Cell丨山东农大李传友教授在番茄中发现了促进植物再生的局部伤口信号REF1
Cell丨山东农大李传友教授在番茄中发现了促进植物再生的局部伤口信号REF1
2024年5月14日，山东农业大学泰山番茄创新研究院李传友教授团队在Cell期刊上发表了一项重要研究成果。研究团队在番茄中发现了一个新的再生因子REF1（REGENERATION FACTOR1），它作为一种局部伤口信号，能够调节植株的局部防御反应和再生能力，并阐述了REF1调控植物再生的分子机制。此外，本研究还提供了一种可能的农业应用策略，以提高作物的再生能力和遗传转化效率。
植物在生长发育过程中经常受到伤害，因此植物进化出了非凡的再生能力来修复受损的植株，植物具有从愈伤组织或单个细胞中再生新的器官或整个植物的能力。这种特别的再生能力，为植物的无性繁殖和农业生产等各种生物技术提供了基础。目前已有不少关于损伤诱发植物再生反应的研究，番茄作为一种模式植物已被应用于相关研究，系统素（植物界发现的第一个小肽激素）和茉莉酸通过共同的信号通路调控植物的系统性防御反应，从而建立了植物系统性防御领域的基本工作模型。但什么是触发植物再生反应的受损信号、植物又是如何接受到受损信号的，尚未被确定。
本研究报道了番茄突变株spr9的特性，spr9是再生能力受损的突变体，该突变体削弱了在调节局部防御反应和再生反应中发挥双重作用的受损信号。该研究表明，SlPep前体基因或其受体基因的缺失会破坏伤口诱导的愈伤组织形成，以及植株地上部分的再生能力，过表达会导致植物再生能力的增强。此外，植物体外应用SlPep，能够显著提高再生能力。因此，将该小肽重新命名为再生因子REF1。很多证据表明，REF1信号通路，通过激活番茄的细胞编程调控因子WIND1的主同源因子SlWIND1，来促进细胞再生。此外，SlWIND1通过转录激活REF1前体基因，放大REF1信号。因此得出结论，REF1是一种促进植物再生的局部伤口信号。REF1的发现为提高难转化作物的再生能力和转化效率提供了一种新的靶目标。
SlPep是一个系统独立的伤口信号，主要调节局部防御反应
已知PRS基因敲除突变株（prs），和系统蛋白信号突变株（spr1-1）缺乏系统防御反应，研究者通过蛋白酶抑制剂标记基因（PI-II）的表达来评估突变株应对损伤的防御反应能力。spr9突变株表现出中等程度的防御能力，研究者将spr9与野生型（WT）Ailsa Craig（AC）杂交，生成了一个具有spr9损伤反应表型的F2群体。F2个体的表型分布表明spr9是由单一隐性突变引起的。
对F2中分别具有spr9、WT损伤应对表型的个体进行了混池测序，在4号染色体中找到了spr9突变株中潜在的致病区域并注释到了SIPep的前体基因PRP发生突变，进一步找到了PRP的前体基因SPR9。PRP与PRS在调节防御基因的局部和系统表达方面具有协同作用。对WT植株体外应用SlPep肽，可诱导PI-II的强表达。
图1 SlPep是一个系统独立的伤口信号，主要调节局部防御反应
SlPep也是一个再生因素
通过传统组织培养，对WT、PRP突变株（prp）、PRS突变株（prs）再生能力进行比较，结果表明，prp和原始spr9在很大程度上丧失了愈伤组织形成和芽再生的能力，而PRP基因过表达植株（PRP-OE）的再生能力与WT相比显著提高。此外prp和spr9突变株的再生缺陷很容易被外源性SlPep挽救，SlPep以剂量依赖性的方式增加了野生型植株的愈伤组织形成能力，说明突变株的SlPep前体基因在组织培养系统中获得再生能力中起着关键作用。
图2 SlPep也是一个再生因子
REF1诱导的植物再生依赖于PORK1
考虑到LRR受体样激酶（LRR-RLKs）、PEPR1和PEPR2是拟南芥Pep植物细胞因子的真正受体，作者通过检测WT和CRISPR-cas9介导的PORK1突变株（pork）中PI-II的表达情况，进一步研究了PEPR1/2的同源受体样激酶——PORK1，结果表明，PORK1介导REF1信号传导，而不是系统素（systemin）的信号转导。
比较WT和CRISPR-cas9介导的PORK1突变株，愈伤组织和地上部分的再生能力，发现PORK1突变株的愈伤组织形成和芽再生能力被破坏，但PORK1过表达株（PORK1-OE）的再生能力强于WT。而且REF1无法挽救PORK1突变体的再生能力，说明REF1诱导的植物再生依赖于PORK1。
图3 REF1诱导的再生依赖于PORK1
PORK1是REF1的受体
过量的非标记REF1竞争生物素-REF1与PORK1Ecto的结合（图4B），表明REF1和PORK1之间存在特异性的相互作用。研究者通过拟南芥原生质体中目的基因的表达、体外磷酸化分析等手段，对PORK1是否可以介导REF1诱导FRK1激酶的表达进行了检测，并评估了PORK1对REF1诱导的MAPK/MPK激活的贡献。结果表明在REF1处理30 min后，WT番茄幼苗中MPK3/6的磷酸化水平显著升高（图4H）。这种REF1诱导的MPK3/6磷酸化在pork1-3幼苗中几乎被消除（图4H），这支持了REF1诱导的MAPK激活依赖于PORK1这一观点，也表明了PORK1是REF1的受体。
图4 PORK1是REF1受体
REF1-PORK1信号通路通过激活SlWIND1的表达来促进细胞再生
已知WIND1基因已被证实在高等植物和拟南芥中，具有促进细胞重编程的功能，用以修复损伤，WIND1也可以诱导番茄愈伤组织的形成。因此研究者对REF1能否以及如何诱导番茄WIND1的同源基因SlWIND1的表达进行了探究。SlWIND1对番茄再生能力的影响与PRS、PR、PORK1基因一致，进一步发现REF1-PORK1信号通路通过激活SlWIND1的表达来促进植物受损后的再生。
图5 REF1-PORK1信号通过激活SlWIND1表达促进再生
SlWIND1介导REF1信号的放大
通过pPRP::GUS报告基因检测发现REF1前体基因的启动子活性可以通过切割下胚轴的损伤来诱导(图6A) 。与WT相比，SlWIND1突变株中（slwind1-3）损伤诱导、REF1介导的PRP表达都受到了损害，表明SlWIND1在PRP的表达过程中发挥了重要作用。通过测序，对推测出的调控SlWIND1结合PRP的启动子进行了检测，并通过EMSAs、ChIP-qPCR进行了验证。证明REF1启动SlWIND1，SlWIND1的激活正向反馈REF1前体基因，即SlWIND1在植物再生过程中放大REF1信号。
图6 REF1和SlWIND1对伤害反应的正反馈调节
REF1提高了难转化作物的再生和转化效率
在几种难转化野生番茄、大豆、小麦、玉米这些双子叶和单子叶植物中，检测了REF1对再生和转化效率的影响，结果表明REF1可以提高包括双子叶植物和单子叶植物在内的多种难转化作物的再生和转化效率。
图7 REF1提高了难转化作物的再生和转化效率
REF1的发现：通过研究番茄突变体spr9，发现了REF1这种植物肽，它独立于系统素（systemin）信号，能够作为局部伤口信号，主要调节植物对伤口的防御反应和再生反应。
REF1的功能：REF1通过与其受体PORK1结合来发挥作用，这一信号传导过程通过激活主转录因子WIND1（WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION 1）来促进植物的再生。
REF1的应用潜力：REF1的应用提供了一种简单的方法来提高难转化作物的再生和转化效率，这对于植物生物技术和作物改良具有重要意义。
REF1-PORK1信号通路：REF1-PORK1信号通路是一个保守的植物细胞素途径，它启动、放大并稳定一个信号级联，协调伤口触发的器官再生。
REF1对植物再生的影响：REF1不仅能够促进植物的再生能力，还能够提高植物的转化效率，这对于遗传转化和基因组编辑技术的应用具有潜在的推动作用。
REF1在不同作物中的应用：测试了REF1在番茄、大豆、小麦和玉米等多种难转化作物中的潜在应用，发现REF1能够显著提高这些作物的再生和转化效率。
总之，REF1是一种局部伤口信号，调节损伤触发的组织修复和器官再生。细胞损伤触发REF1配体的产生，该配体结合并激活其受体PORK1，以启动SlWIND1调节的再生反应。除了协调细胞重编程以进行再生外，激活的SlWIND1还可以结合REF1前体基因的VWRE基序来激活其表达，从而放大REF1信号以进行再生反应。除了协调细胞重编程以进行再生外，激活的SlWIND1还可以结合REF1前体基因的VWRE基序来激活其表达，从而放大REF1信号以进行再生反应。REF1-PORK1和SlWIND1之间的正反馈调控机制可以在不断变化的输入信号下放大/稳定REF1信号。未来的分子遗传学研究有望阐明REF1介导的再生反应被适当减弱以维持信号稳态的机制。
参考文献：
Yang W, Zhai H, Wu F, et al. Peptide REF1 is a local wound signal promoting plant regeneration. Cell. 2024 May 14:S0092-8674(24)00466-5. doi: 10.1016/j.cell.2024.04.040. Epub ahead of print. PMID: 38781969.