红细胞裂解液原理与使用指南

红细胞裂解液原理与使用指南

红细胞裂解液（Red Blood Cell Lysis Buffer，亦称 ACK Lysis Buffer）是一种广泛应用于生物医学实验中的试剂，主要用于去除样本中的红细胞，从而实现对有核细胞的富集。本文将详细介绍红细胞裂解液的原理、使用方法和配方，帮助科研人员更好地掌握这一实验技术。

红细胞裂解液简介

红细胞裂解液（Red Blood Cell Lysis Buffer，亦称 ACK Lysis Buffer）是一种高效、简便的红细胞去除试剂。它通过特异性裂解红细胞，实现对有核细胞的富集，同时不损伤有核细胞，确保细胞活性与完整性。这一方法广泛应用于经酶消化分散的组织细胞分离纯化、淋巴细胞分离纯化，以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经裂解处理后的组织细胞中无红细胞残留，可直接用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等后续实验。

保存条件

红细胞裂解液应在 2-8℃的低温环境下保存，以维持其稳定性和有效性，确保实验结果的可靠性。

配方

以下是 ACK 裂解液的详细配方，适用于 1000 mL 的配制：

配制步骤如下：

1. 将上述试剂依次溶解于 850 mL 去离子水中。
2. 使用 pH 计检测溶液 pH 值，调整至 7.2-7.4，确保溶液呈中性，避免对细胞造成损伤。
3. 最后，加去离子水定容至 1000 mL，充分搅拌均匀。
4. 配制好的裂解液可在室温下保存长达 6 个月，但建议在使用前摇匀，以确保成分均匀分布。

使用说明

组织细胞样品处理

1. 细胞消化与离心：将新鲜组织经胰酶或胶原酶等消化分散成单个细胞悬液，然后进行离心，弃去上清液，收集细胞沉淀。
2. 裂解液加入与混匀：从 4℃冰箱中取出预冷的裂解液，按 1:3-5 的比例向细胞沉淀中加入裂解液（1 mL 细胞压积加入 3-5 mL 裂解液），轻轻吹打混匀，使裂解液与细胞充分接触，确保红细胞裂解完全。
3. 离心去除裂解液：以 800-1000 rpm 的速度离心 5-8 分钟，离心后弃去上层红色清液，此时红细胞已被裂解并去除。
4. 细胞洗涤：收集沉淀部分，加入适量的 Hank’s 液或无血清培养液，再次离心洗涤 2-3 次，以彻底去除残留的裂解液和红细胞碎片。
5. 裂解不完全处理：如果裂解不完全，可重复步骤 2 和 3，直至红细胞完全去除。
6. 细胞重悬与后续实验：将细胞重悬于适当的溶液中，用于后续实验。如果需要提取 RNA，建议从步骤 4 开始使用 DEPC 水配制的溶液进行操作，以避免 RNA 降解。

血细胞处理

1. 抗凝血离心：取新鲜抗凝血，进行离心，弃去上清液，收集细胞沉淀。
2. 裂解液加入与混匀：从 4℃冰箱中取出预冷的裂解液，按 1:6-10 的比例向细胞沉淀中加入裂解液（1 mL 细胞压积加入 6-10 mL 裂解液），轻轻吹打混匀，使裂解液与细胞充分接触，确保红细胞裂解完全。
3. 离心去除裂解液：以 800-1000 rpm 的速度离心 5-8 分钟，离心后弃去上层红色清液，此时红细胞已被裂解并去除。
4. 细胞洗涤：收集沉淀部分，加入适量的 Hank’s 液或无血清培养液，再次离心洗涤 2-3 次，以彻底去除残留的裂解液和红细胞碎片。
5. 裂解不完全处理：如果裂解不完全，可重复步骤 2 和 3，直至红细胞完全去除。
6. 细胞重悬与后续实验：将细胞重悬于适当的溶液中，用于后续实验。如果需要提取 RNA，建议从步骤 4 开始使用 DEPC 水配制的溶液进行操作，以避免 RNA 降解。

作用原理

红细胞裂解液的核心成分是氯化铵。在裂解过程中，氨根离子（NH4⁺）无法通过细胞膜，而其他离子（如氯离子 Cl⁻）可以自由通过。这种选择性通透性导致细胞内外离子浓度差异，形成渗透压差。外部的水分会因渗透压差扩散至细胞内，使红细胞膨胀直至破裂，从而实现裂解效果。而有核细胞由于细胞膜结构和成分的差异，对裂解液的耐受性更强，不会受到损伤，从而实现红细胞与有核细胞的有效分离。