单细胞多组学揭示INO80在心力衰竭中的作用机制

单细胞多组学揭示INO80在心力衰竭中的作用机制

中国医学科学院阜外医院王利教授团队在《Circulation》杂志上发表重要研究成果，揭示了染色质重塑复合物INO80在心肌稳态和心力衰竭中的作用及机制，为心力衰竭的发病及治疗提供了新的思路。

心力衰竭（HF）是许多心脏病（如心肌梗死、高血压、主动脉瓣狭窄、瓣膜闭锁不全和心律失常等）的终末阶段，由于其发病率和死亡率较高，是医疗保健系统面临的一大挑战。目前的疗法主要侧重于减轻心脏的血流动力学负担。

转录调控网络以特定细胞类型的方式控制着组织稳态和疾病进展。染色质调控因子与转录因子协同精细控制基因时空有序表达，从而在生物的发育与疾病中发挥着重要作用。心肌细胞作为心力衰竭干预的目标细胞类型而备受关注。因此，阐明心肌细胞中错综复杂的转录信号如何协同稳定调控细胞命运至关重要。染色质重塑子INO80在心脏发育过程中有重要作用，但其在成年心肌细胞中的作用仍然未知。

该团队的研究亮点主要包括：研究整合了人类样本、遗传小鼠模型和基因组方法，包括bulk RNA-seq、scRNA-seq、染色质免疫沉淀和高通量测序，以及染色质开放性高通量测序（ATAC-seq），以确定染色质重塑复合物INO80在心脏稳态和功能障碍中的作用。

INO80与心脏发育及心力衰竭的关系

为了探究INO80在心脏中的作用，首先检测了它在心脏成熟过程中的表达，结果显示心脏中INO80的表达在出生后持续增加(a-c)。而且Ino80在心肌细胞中的表达显著高于非心肌，提示其在心脏成熟过程中可能发挥着作用(d)。为了探究INO80和心衰的关系，作者在TAC小鼠模型中检测了INO80的表达，发现存在显著上调，而且主要是在衰竭心脏的心肌细表达(e-i)，在心衰患者心脏中也存在着一致的效应(j-n)。

图1 INO80与心脏发育及心力衰竭的关系

心肌细胞异位表达Ino80导致射血分数降低的心力衰竭

作者构建了tamoxifen诱导的心肌特异性Ino80过表达小鼠(a-c)。Ino80-OE小鼠的存活率显著下降，在d20时，存活率仅为13%(d)。超声结果显示Ino80-OE小鼠存在快速的射血分数(EF)值下降；小鼠的心重体重比也显著增加(f)。HE染色结果显示Ino80-OE小鼠心脏大小显著增加(g)，WGA染色显示细胞大小显著增大(h-i)。

图2 心肌细胞异位表达Ino80导致射血分数降低的心力衰竭

心肌细胞中Ino80过表达再现心力衰竭的分子特征

随后在Ino80诱导表达后的D0、 D2、D4和D6进行了RNA-seq。结果显示随着时间进展，心脏的转录越来越偏离正常心脏。对DEG进行了聚类分析，以观测INO80-induced HF的基因表达模式，结果显示存在4个模块(a)。

Ino80的异位表达导致对心功能重要的转录调节网络重构

在INO80调节的众多基因中，作者想要去寻找哪些基因在Ino80过表达时更快的发生了变化，并探究其是否形成了调控网络以更好的调节生物学过程。因此作者对诱导Ino80过表达后0/1/2/3天的小鼠心脏心肌细胞进行了单细胞测序(a)，一共得到了3364个细胞，基因中位数为3523(b)。Ino80在诱导后表达显著升高(c)。使用HF index references，作者计算了其与各个心肌细胞Ino80表达的相关性，发现呈显著正相关(d)。为了探究Ino80高表达下反应最迅速的基因，对D0, D1心肌进行了拟时序分析(e, f)。D1心肌的Ino80呈差异性表达(f)。最后，作者根据Ino80的表达将细胞进行排序，得到了3个D0和D1的DEG基因表达模式(g)。C1主要与线粒体代谢和肌纤维装配有关，这些基因的表达与Ino80的表达负相关(g,h)。C2的基因主要参与应对外界刺激反应，并参与血管生成和炎症。C3的基因主要与肌肉发育和适应有关，且主要在Ino80接近表达峰值时表达，提示分子和细胞水平HF的建立(g,h)。

图4Ino80的异位表达导致对心功能重要的转录调节网络重构

目的基因上INO80位点的改变是转录调控网络重构的基础

接着，作者分离了对照和Ino80-OE心脏的心肌细胞，进行了染色质免疫沉淀(ChIP)来确定INO80的直接下游靶点，提示INO80在基因增强子中具有调节作用。作者联合Sham和TAC组小鼠心脏的ChIp数据进行了分析。结果显示Ino80过表达组和TAC鼠共有204和730个基因显示出INO80 occupancy的增强或下降(a, b)。增强或下降的两个基因集都富集到了与心脏发育和病理过程的基因集，表明INO80对心肌细胞命运和功能的总体控制(c, d)。其中204和730个基因分别在人HF和对照心脏的丰富表达基因中显著富集，提示INO80功能的物种保守(e, f)。更进一步，作者将改变INO80的TFS与INO80过表达后活性改变的123个调节因子重叠，并鉴定出79个共同的，提示INO80直接调节79个核心调节因子，包括MEF2A、MEF2C、GATA4、PBX1、KLF4、ATF3等，这些调控因子可能构成心功能调节的核心调节网络(g)。核心的79个调节因子在与心功能相关的过程中显著丰富，如肌肉组织发育和心脏生长(h)。在5568个调节子下游靶基因中，有2623个基因显示INO80结合发生改变，并类似地富集于心肌细胞发育分化、膜电位调节、细胞连接组装和心室发育等心功能相关过程(i, j)。随后作者将OE的ChIP，TAC的ChIP和单细胞数据三者取了交集，得到26个结合增加的TF，作者用ChIP-qPCR进行了验证(k-m)。

Ino80的过度表达重塑了染色质的可及性，从而重塑了转录调控网络

INO80占比的显著变化使得作者想要去探究染色质结构。因此作者又做了ATAC-seq。作者鉴定出了3种染色质可以性变化模式。未变化的有7271基因，占57.3%。上调的有504基因，占4%，下调的有4916基因，占38.7%(a)。对后2类基因的基因分析，在与心肌收缩、心脏形态发生和心肌肥厚相关的生物学行为中显著丰富(b)。随后作者将ChIp数据与ATAC-seq的数据取了交集，探究INO80对染色质可及性的直接影响。与预期一致，INO80过表达增加的基因显示染色质活性增强，反之亦然(c-e)。与此一致，INO80结合降低的患者在INO80过度表达时染色质可及性降低。

MEF2A促进INO80复合物向下游靶基因的募集

作者整合了高通量ChIP，ATAC和单细胞的数据，得到47个上调的T/regulon和其下游的870个靶基因 (a, b)。其功能与心脏功能显著相关(c)。随后作者使用了ATAC的数据以探究870个靶基因上常见的DNA结合基序，并预测了10个TFs与INO80下游47个调节子重叠，包括SP1、KLF4、MEF2A等(d)。由于这10个TFs受INO80调控，作者假设这些关键TFs不仅是INO80的下游靶点，而且可以作为INO80的DNA-bound partner从而形成一个调控网络以影响INO80的基因表达。由于MEF2A的表达显著下降(e)，作者以MEF2A为例来验证这个假设。在预测的MEF2A结合基序基因上，INO80的信号强度显著高于未预测的基因(f, g)。为了验证MEF2A在INO80结合中的作用，作者使用了慢病毒shRNA并观测到了显著下降的INO80靶基因(h, i)。因此, Mef2a不仅是INO80过表达而表达抑制的靶基因，其同样介导了INO80对靶基因的调控。

心肌细胞INO80缺失预防心力衰竭进展

最后，作者探究了抑制INO80的表达是否可以作为HF治疗的可行方法。构建了心肌细胞特异性敲除的Ino80-cKO小鼠(a)。结果显示敲除小鼠心功能显著改善(b-e)，心脏扩张和纤维化都显著改善(f-i)。心重体重比下降(j)，心衰标志物的表达也显著下降(k)。

图8 心肌细胞中INO80耗竭可防止心力衰竭进展

结论

总体而言，该研究结果揭示了INO80依赖性染色质景观和转录网络重塑是心力衰竭中心脏功能障碍的主要机制，并表明INO80可作为心脏疾病治疗的潜在预防或干预靶点。

参考文献

Ren Z, Zhao W, Li D, et al. INO80-Dependent Remodeling of Transcriptional Regulatory Network Underlies the Progression of Heart Failure. Circulation. 2023 Dec 28. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.065440. Epub ahead of print. PMID: 38152931.