「煮蛋白」是玄学还是科学?揭秘 SDS-PAGE 前的关键一步!

「煮蛋白」是玄学还是科学?揭秘 SDS-PAGE 前的关键一步!

蛋白免疫印迹（Western Blot）是实验室里常用的蛋白质分析技术，不仅能估算蛋白的分子量，还能检测蛋白的表达量。但在进行SDS-PAGE电泳之前，有一个关键步骤叫做"煮蛋白"（煮样），它直接决定了实验结果的可靠性。

为什么要煮蛋白？

1. 破坏蛋白的高级结构
   蛋白质的高级结构包括二级、三级和四级结构，这些结构会影响电泳时的迁移速率。通过煮沸处理，可以破坏这些非共价相互作用，使蛋白质转变为线性多肽链，从而实现更精确的分子量分析。

2. 促使SDS与蛋白充分结合
   SDS是一种阴离子去污剂，能够破坏蛋白质的疏水作用、氢键和二硫键，形成带有大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。在高温处理下，SDS与蛋白质充分结合，使其完全变性并带上大量负电荷，这样蛋白质在电泳中的迁移率主要取决于其分子量。

3. 灭活蛋白酶，防止蛋白降解
   高温处理会导致蛋白酶的空间结构发生改变，破坏其活性中心，从而防止蛋白质在实验过程中被降解。

4. 提高制备蛋白样品的稳定性
   高温处理可以降低蛋白质分子间的相互作用力，增强其热稳定性，减少聚集和沉淀。同时，煮沸还可以清除样品中的气泡与杂质，保障电泳样品的纯度。

蛋白煮样的正确操作方法

首先，将抽取的蛋白量与Loading Buffer按照比例混合，然后放置在95100℃沸水浴中。常规煮样时间是35分钟，如果样品浓度过高，则可能需要煮10分钟或者增加Buffer继续煮。但如果煮样时间过长，蛋白可能会凝固，如蛋白出现明显的沉淀和水分层，则应丢弃，这样的蛋白失去继续进行Western Blot的意义。

上样缓冲液含有甘油，从而使溶液比凝胶电泳缓冲液黏稠，样品容易沉入凝胶上样孔中。上样缓冲液还包含跟踪染料（溴酚蓝），该染料也会在凝胶中迁移，指示电泳迁移距离，显示电泳进展情况。另外就是含有还原剂和DTT，带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，使蛋白的迁移率仅取决于蛋白质的分子质量的大小。

哪些样本需谨慎煮样？

1. 膜蛋白
   对于膜蛋白样品通常不能直接煮沸处理，一般选择37℃放置10分钟进行蛋白变性处理。膜蛋白具有特殊的疏水结构，在高温煮沸时容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体，使得蛋白分子量发生变化，导致蛋白检出条带大小或者位置不对；并且可能遮蔽抗体识别表位，导致蛋白无法被抗体识别（结果无信号）；蛋白聚集还容易堵塞加样孔口，在泳道上层形成“鬼带”（下层则没有信号/条带）。

但是，不是全部膜蛋白都会出现这种情况。膜蛋白是否煮样，需要进行预实验（可根据蛋白的属性，在50-70℃之间进行热变性）。如果膜蛋白煮样后，跑胶结果出现拖带、堵孔、鬼带”、弥散、蛋白大小不对的情况，就需要谨慎处理了。

2. 热敏感蛋白
   有些蛋白对温度较为敏感，如线粒体蛋白、溶酶体蛋白或者热休克蛋白等，高温可能导致蛋白聚集或者降解，此类蛋白不适合煮样。可采用37℃放置10-30分钟的方法进行处理。

煮样后样本该如何保存？

煮样后的样品应尽快使用，如果实在需要保存，可以分装成小份保存在-20℃或-80℃冰箱（不建议4℃保存），避免反复冻融。保存半年以上的样品再次使用前需补加适量的还原剂重新煮样后再使用。煮样后样本若经过长时间保存，一是易发生内源性剪切，部分蛋白降解；二可能会蛋白发生聚集，形成了复合物，从而堵塞浓缩胶和分离胶加样孔口。所以建议请勿长时间保存处理好的样本。