细胞世界的“CT扫描”：流式分析技术深度解析与实战应用

细胞世界的“CT扫描”：流式分析技术深度解析与实战应用

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种基于流式细胞仪的高效分析技术，可对细胞或微粒的理化特性进行多参数定量检测及分选。凭借其快速、精准和多功能的优势，该技术已广泛应用于基础科研、临床诊断和药物开发等领域。

流式细胞分析的特点

1. 速度快：检测速度可达到每秒数千至上万个细胞；
2. 灵敏度高：每个细胞上只需带有 100~300 个荧光分子即可被检测出来；
3. 多参数：多色荧光染色同时分析单个细胞或者生物微粒的多特征；
4. 纯度高：可以把指定特征的细胞分选出来，目的细胞的纯度高达 99% 以上；
5. 无毒害：能保持细胞不被破坏，继续进行无毒害定性、定量分析及分选。

技术原理与仪器结构

流式细胞仪集激光技术、流体力学、光学检测及计算机分析于一体，其核心功能是通过检测细胞的散射光和荧光信号，实现多参数分析。

图片来源爱博泰克

• 散射光信号：前向散射光（FSC）反映细胞大小，侧向散射光（SSC）反映细胞颗粒度和内部结构。
• 荧光信号：标记特异性抗体的荧光染料激发后发射光信号，用于检测抗原表达、DNA含量等参数。
• 分选功能：通过电偶转移技术，从混合群体中分选目标细胞亚群。

核心应用场景

流式细胞仪的多参数分析能力使其成为复杂生物学研究的利器，以下为其主要应用方向：

1. 免疫表型分析

• 淋巴细胞亚群检测：通过CD3、CD4、CD8等标志物区分T细胞亚群（如Th1、Th17、调节性T细胞），评估免疫功能状态。
• 正常人：T 淋巴细胞 CD4+/CD8 + 大约为 2/1；比值升高：表明机体免疫机能亢进，见于自身免疫性疾病，如 SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等
• 图片来自丁香医生
• 白血病免疫分型：结合CD34、CD45等标志物，明确白血病细胞起源及分化阶段，辅助诊断与治疗。

2. 细胞周期与凋亡检测

• 细胞周期：利用PI等DNA结合染料，量化G0/G1、S、G2/M期细胞比例，评估肿瘤细胞增殖状态。
• 凋亡检测：Annexin V结合磷脂酰丝氨酸外翻，配合PI区分早期凋亡与晚期凋亡细胞。

3. 细胞分选与功能研究

• 干细胞分选：通过Lin⁻、CD34⁺等标志物富集造血干细胞。
• 细胞因子分泌分析：使用布雷菲德菌素A阻断分泌途径，检测胞内IL-4、IFN-γ等因子表达。

4. 临床诊断

• HLA-B27检测：作为强直性脊柱炎的重要标志物，流式检测HLA-B27具有高灵敏度和特异性。
• 肿瘤微环境分析：通过CD163、CD206等标志物区分M1/M2型巨噬细胞，评估肿瘤免疫状态。

实验流程与关键策略

流式实验需严格遵循标准化流程，并关注以下核心环节：

1. 样本制备
2. 抗体选择与配色
3. 荧光染料匹配
4. 多色Panel设计：遵循“荧光溢漏最小化”原则，合理分配激光通道
5. 染色与对照设置
6. 封闭非特异性结合
7. 实验对照：包括空白对照（本底荧光）、同型对照（非特异性结合）及FMO对照（补偿调节）。
8. 数据分析

• 圈门策略：基于FSC/SSC初步圈定目标细胞群，结合荧光信号进一步细分亚群。
• 降维算法：t-SNE或FlowSOM可辅助可视化多参数数据，揭示隐藏细胞群体。

常见问题与优化方案

1. 染色弱或无信号

• 原因：抗体浓度不足、靶标表达低或固定破膜不当。
• 方案：滴定抗体浓度，选用间接染色法（一抗+荧光二抗），验证固定液（胞浆蛋白用皂素，核蛋白用Triton X-100）。

2. 高背景信号

• 原因：死细胞残留、抗体浓度过高或Fc受体未封闭。
• 方案：增加洗涤次数，优化封闭步骤，使用可固定活性染料。

3. 异常分群

• 原因：补偿设置错误或细胞粘连。
• 方案：利用单染对照精确调节补偿，过滤去除粘连细胞。

流式细胞仪凭借其高通量、多参数的优势，已成为生命科学研究的核心仪器之一。实验成功的关键在于严谨的流程设计、合理的抗体配色及精准的数据分析。随着新型荧光染料（如ABflo®系列）和自动化分选技术的发展，流式细胞仪将在单细胞组学、免疫治疗及精准医疗中发挥更重要的作用。