重大发现！《自然·通讯》：蚊子传播疾病，靠的就是它！

重大发现！《自然·通讯》：蚊子传播疾病，靠的就是它！

随着夏季的到来，蚊子又开始活跃起来。这些小小的吸血生物不仅令人烦恼，更是许多疾病的传播者。最近，科学家们在《自然·通讯》上发表了一项重要研究，揭示了蚊子唾液中一种名为SGS1的蛋白质如何帮助病原体感染人体。这一发现不仅加深了我们对蚊虫传播疾病机制的理解，也为开发新的疾病预防方法提供了重要线索。

又到了一年一度跟蚊子做斗争的季节！炎炎夏日，在夜晚乘凉的，除了你和手中的西瓜，还有一位“不速之客”——蚊子。尤其是处于温带南侧、亚热带气候地区的我国南方省份，蚊虫密度简直到了沈复《童趣》中“夏蚊成雷”的地步。

且不说各种各样的蚊子如何烦人唬人，单论它们传播疾病的能力，我们就会发现——这些吸血生物，甚至还很致命！

“如果列一张威胁人类的致命动物排行榜，蚊子肯定会名列榜首，而且不同于老鼠、毒蛇，它们简直是防不胜防。”按现有的分类方式，埃及伊蚊、喙库蚊和冈比亚按蚊可以说是是蚊子传播病原体的“罪魁祸首”。流行性脑炎、登革热、疟疾、寨卡病毒……每年死于由蚊虫传播疾病的人数高达上百万；而据估计，自人类诞生以来，竟有一半的人类死亡与蚊子有关。

蚊子作为体型小、能够飞行的无脊椎动物，在庞大笨重的哺乳动物面前，真正做到了“无孔不入”。因此，针对这些流行病的防治工作，很大程度上也要围绕蚊子进行。要想能有效防治蚊虫传播的流行疾病，就要对这一传播过程建立比较深入的了解。数十年来，生物学家一直致力于解析各种病毒、原生动物等病原体从蚊子唾腺分泌到唾液之中，随着蚊子的叮咬过程而被注入血液，而在此之后有效感染人类细胞的过程。

人类对于蚊虫传播过程的研究揭示了一个惊人的事实：蚊子的“唾液”竟然可以“帮助”病原体感染人体！为了能在人体内持续吸血，蚊子分泌的唾液分子通过抑制血小板聚集、血液凝固和血管收缩来促进吸血。然而，蚊子的唾液和唾液腺中发现的一些蛋白也被证明可提高传播疾病的严重程度。实验证明，蚊子分泌的唾液能够有效增强恶性疟原虫的感染性，并加重疟疾的疾病进展。

迄今为止，人类已经从蚊子的唾液之中分析出了多种蛋白成分。然而，还有高达30%-40%的唾液蛋白无法被归属到任何一种已知的蛋白质家族之中，也尚未发现具备任何已知的分子功能。其中，由埃及伊蚊（Aedes aegypti）唾腺分泌的一种具备超大分子量（>300kDa）的单体蛋白可以说是其唾液中浓度最高的“毒中翘楚”。这就是我们今天的主角——“唾腺表面蛋白”SGS1。

SGS1由雌性埃及伊蚊的唾腺特异性地分泌，疟原虫感染人体的过程中发挥着重要作用。长久以来，研究者一直想要确定这一蛋白的具体结构，但常常无功而返。一方面，通过体外重组制备的SGS1蛋白通常不具备正常的折叠和修饰情况；另一方面，这一蛋白中大部分的序列根本就不编码人类已知的有序结构，导致生物信息学预测方法也失去了用武之地。

在这种情况下，来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）的周正洪教授带领实验团队，利用团队先前独立开发的Cryo-ID计算方法，结合冷冻电镜单颗粒分析技术，确定了蚊子唾液中此类蛋白的“天然”结构，解释了SGS1在蚊虫叮咬过程中“协助”病原体入侵人体细胞的生物学过程。相关文章于2022年发表在顶级期刊Nature Communication上，题为Native structure of mosquito salivary protein uncovers domains relevant to pathogen transmission。

研究人员发现，与化学测定的结果类似，SGS1在埃及伊蚊的唾液中的确有着很高的丰富度。在冷冻电镜和负染色电镜的拍摄下，符合这一蛋白预期大小的颗粒数量很多。通过冷冻电镜2D类平均和3D结构重建的方法，研究人员获取了蚊子唾液中茧状蛋白原子级别的高分辨率结构（3.3Å）。

根据冷冻电镜拍摄的结构，研究人员采取实验室开发的Cryo-ID算法（通过原子分辨率三维结构直接分析得到蛋白质的“身份”，可以说是冷冻电镜领域的“人脸识别”技术），确定这一“茧状颗粒”的“身份”就是SGS1。接下来，他们根据这一高分辨率的解析结果，成功搭建了这一蛋白从第1-第3042位氨基酸的近全长结构（图1；全长为3364个氨基酸）。

从结构图上，研究人员惊讶地发现，之前被预测为所谓“跨细胞膜”区段的TM（transmembrane，图1红色部分）结构域，在SGS1的天然结构中正被“包埋”在其他结构域组成的外壳之下。SGS1蛋白总共可以划分为7个不同的结构域（图1中不同颜色）。

图1: SGS1蛋白的三维结构

不同于一般的唾液蛋白，SGS1的来源也比较“特殊”。之前的研究认为SGS1是来源于原核生物和蚊子共生过程中发生的“水平基因转移”，也就是说，在很长时间以前，来源于原核生物（细菌等）的一段基因转移并插入到了蚊子的基因组中。这一基因在漫长的进化过程中被保留下来，并且成为了蚊子唾液中的重要蛋白成分。研究人员通过系统发生树说明，各种蚊子彼此之间有着比较相似的SGS1蛋白序列与结构，而细菌中的这一蛋白则要短得多。这也暗示了这一蛋白在蚊虫传播疾病的过程中承担着“独特”的作用。

从线性的序列上看，从N端到C端，整个SGS1蛋白由其本底的Rhs-YD重复（一种特定氨基酸排列方式；图1，蓝色）结构域组成“背景”，其他结构域嵌入其中，将其隔断。Rhs-YD重复结构，连同其下方的“β螺旋桨结构域2（图2，灰色）”一起，组成一个内部具有空腔的“外套”（图2，绿、粉、黄、蓝是图1中蓝色结构域的细分）。这一外套外壳壁面的组织方式类似于一个左手螺旋，中间围成一个空腔；在Rhs-YD重复结构域组成的螺旋外套的最底层，壁面打开了一个“门洞”，与外界相连通（图2，亮蓝色部分）。

图2: SGS1蛋白外壁部分，由多层堆叠组成中空管道

这一蛋白部分的结构和已知的细菌Tc toxin毒素和人神经teneurin蛋白类似。将三者进行结构上的比较，可以发现teneurin蛋白明显较短。这与不同蛋白“外壳”之中埋藏的结构大小直接相关：SGS1内部埋藏了长达230个氨基酸的蛋白链（TM结构域），Tc toxin埋藏了大约200个氨基酸，而teneurin内部仅有大约90个氨基酸。

图3: 与SGS1类似结构蛋白的比较

Rhs-YD组成的蛋白管道的“顶端”由一个较小的“核心”（Rhs core）结构封口（图3，绿色部分）。这一结构之所以被称为“核心”，是因为紧接着它的下游，就是一连串被埋藏在管道内部的氨基酸链，也就是前面提过的TM结构域。通过类似结构蛋白的对比，研究人员发现，在“核心”结构上存在一个蛋白质自剪切位点（图4）。这就意味着，在这个“核心”处，SGS1能够剪切自己，让外面的“管道外套”和包埋其中的链状的“TM结构域”分离开来。这和细菌Tc toxin毒素释放毒性结构域的方式类似。

图4: “核心”结构上的蛋白质自切割位点

结合MS质谱技术、局部蛋白的三维细节和氨基酸性质，研究人员确定了这一“核心”结构中自剪切位点的生物学意义：在唾液腺内部，“核心结构”保持稳定；在蛋白被分泌到伊蚊唾液中后，受到环境的化学变化影响，蛋白质发生结构变化，自剪切位点成立，使蛋白在此处断裂。断裂后的TM结构仍然通过疏水相互作用稳定地保存在“外壳”内部，受到周围簇拥着它的β桶结构域的保护。

在外套管道的内部，TM结构域，也就是所谓的“跨膜”结构域，呈现出的结构远远超出了人们预料的结果。如果你把这一段氨基酸输入计算机，它会告诉你这里是非常经典的“跨膜”结构域：呈多段有序的螺旋状，中间以短促的“环”相连，和经典的蛋白质跨膜结构域别无二致。然而，在SGS1蛋白中，它呈线性结构，从“核心”出发，一路向下贯通，达到“管道外套”的末端。在外套末端，它又折返方向，一路向上，最终达到前述管道中间的“门洞”部位，从此处伸展出去。这条氨基酸链总体呈现出螺旋-无序环相互交替的结构排列，以疏水相互作用为主要的互作方式，结合在管道的内部。

图5: 内部TM链独特的“徘徊”结构

对比发现，对于内部的长链来说，这种先向下延伸、达到低端再折返、最终从中间孔洞离开的结构组织方式，和teneurin蛋白比较类似，而和Tc toxin恰恰相反。在Tc toxin毒素蛋白中，这一长链从低端的出口直接离开，再不折返。

在第3042个氨基酸之后的剩余结构，并未被冷冻电镜的解析所发现。从序列上看，这一部分包含一个潜在的金属蛋白酶（furin）切割位点。根据不同部位提取出的蛋白质鉴定结果，研究人员推测，这个位点的切割早在蛋白质被分泌出唾液腺之前就已经发生。因此，在唾液中并不能获得这一尾端蛋白的三维结构。

在主体结构之外，研究人员还获得了5个外置的受体结构域（位于顶端的β螺旋桨结构1、楔形结构域、结合糖分子的凝集素结构域、糖结合模体、和位于底端的β螺旋桨结构2）。其中，楔形结构域（粉色）构成一种前所未见的独特结构域，并为两条二硫键所维持着。β螺旋桨结构2构成整个外套的最下方一层，同时也是内部TM链结构的“折返点”。不同于位于顶端的、完整的β螺旋桨1，在TM内部链结构折返的部位，螺旋桨2于经典“螺旋桨”的结构基础上发生了一定的变化，其中一个“扇叶”的部分发生了偏移。总体而言，SGS1蛋白外围的多个受体结构域展现了它强大的结合目标蛋白/糖分子的生物学能力。

图6：SGS1蛋白丰富的受体结构域

这些结构域代表了SGS1和其他蛋白互作的强大能力
黄色为顶端的“β螺旋桨结构1”
粉色为“楔形结构域”，亮蓝色为底端的“β螺旋桨结构2”
d-e图展示螺旋桨结构在TM链影响下的偏移

冷冻电镜的研究结果为蚊虫传播疾病的分子过程建立了模型。

• 最初，最靠近C端的金属蛋白酶裂解位点在唾腺细胞内被酶切断，剩余部分分泌到唾液腺的特定位置储存起来；
• 在此处，疟原虫孢子虫/疟原虫病毒借助剩余的 SGS1 片段表面的多个受体结构域，侵入蚊子的唾腺细胞；
• 接下来，SGS1 在其自催化位点处发生裂解，并随即被分泌到唾液中；
• 被切断而脱离本体的TM 结构域仍然依靠疏水相互作用完全嵌入SGS1的Rhs/YD外壳中，受其保护。
• 在蚊虫吸血的过程中，SGS1随着唾液一同被注入哺乳动物的血管之中，SGS1依靠受体结合结构域和宿主细胞接触，内部的TM结构域依靠疏水作用力（躲避和水分子接触的力量），从外套内部的输水环境中释放到细胞膜的疏水环境中；
• TM嵌入目标细胞后，开始协助病原体传播与侵染宿主细胞。

总结而言，研究人员利用冷冻电镜方法，结合蛋白分子的“身份识别”算法，从天然的埃及伊蚊唾液样本中鉴定得到了唾液蛋白SGS1的高分辨率三维结构。这一结构的解析加深了我们对于病原体通过蚊虫在人类社会中传播的生物学理解，并且为药物研发、医学研究领域奠定了重要基础。

周正洪教授团队开发的Cryo-ID方法能够从蛋白纷杂的天然样本中，通过冷冻电镜三维重构的结果，“看脸识人”，识别和鉴定目标蛋白的身份。这一技术与冷冻电镜对蛋白质分子结构的解析相结合，将在医学鉴定、药物创新等多个领域发挥重要作用。中科微末团队在生物大分子及其复合体的三维结构解析方面技术成熟、经验丰富，能够在原子级分辨率解析多种生物大分子材料的三维结构。我们致力于为药企和高校医院科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率的结构解析服务，助力创新药物研发和科研成果转化，帮助科研人员实现“原子结构自由”。

关于cryo-ID，我们之前介绍过：
《自然·方法》发表了中国科学家团队破译疟疾的“结构密码”
点击文章标题阅读原文

SGS1蛋白的三维结构