弹性蛋白的研究进展
弹性蛋白的研究进展
弹性蛋白是动物体内一种重要的细胞外基质蛋白，其独特的结构和特性使其在生物医学领域具有广泛的应用前景。本文将详细介绍弹性蛋白的研究进展，包括其结构、特性、应用以及重组弹性蛋白的制备流程。
弹性蛋白简介
弹性蛋白在生物体内的含量仅次于胶原蛋白，在组织伸缩运动、抗外力形变等方面发挥着不可替代的作用，最大的特点即赋予组织弹性。在不同的组织中，弹性蛋白的含量也有差异，例如在承受骨骼间运动负荷的韧带中，弹性蛋白含量最高(80%)，主动脉中弹性蛋白占干重的30%-50%、肺中的含量为10%-25%、皮肤中为3%。
弹性蛋白的结构
弹性蛋白是一种高度交联、高度不溶的材料，但是它的单体--原弹性蛋白(tropoelastin)却是水溶性的。原弹性蛋白含有700-760个氨基酸残基，其中95％的氨基酸为非极性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等。原弹性蛋白从细胞中分泌出来后分布到细胞表面，在赖氨酰氧化酶的催化氧化下形成其特有的交联结构而形成弹性蛋白。弹性蛋白是人体中广泛存在的一种结构蛋白，赋予血管、韧带、皮肤等重要器官弹性和柔韧性。
图2.天然(全长)弹性蛋白的分子结构模拟图
弹性蛋白的特性
正是弹性蛋白的这些特殊结构使其有了许多有用的特性：
由于弹性蛋白中的主要成分是甘、脯氨基酸，因此可形成较宽的-β-螺旋--大量的疏水性氨基酸侧链都在螺旋内部，而亲水性的甘氨酸则在螺旋外部，从而弹性蛋白就具有亲水性、亲脂性、弹性和坚韧性；
弹性蛋白特殊的结构也使得它不溶于稀酸、碱、醇和盐溶液，仅在一些极性溶剂中出现溶胀现象；
弹性蛋白的热稳定性也很好，热分解过程发生在220℃～380℃；
弹性蛋白的代谢率相当低，经放射性同位素测定，其半衰期约为70年，而且这种纤维状蛋白分子对物理、化学甚至某些酶的攻击有很强的耐受和抵抗能力，弹性蛋白交联凝胶可以作为组织再生支架，为细胞生长提供有益的微环境，因此其在医学美容、护肤领域具有广阔的应用前景。
图4.弹性蛋白的可逆相变机理
3.1 弹性蛋白可逆相变
可逆相变(InverseTransitionCoacervation)是弹性蛋白一个重要的理化性质。具体表现为：一定浓度的弹性蛋白在受热后会自发聚集形成难溶多聚体，溶液由澄清变为浑浊，进而析出沉淀；当温度降低，弹性蛋白沉淀消失，以游离态的形式重新溶解分散，溶液恢复澄清。而游离态与凝聚态之间的临界转变温度，被称之为弹性蛋白的可逆相变点。
弹性蛋白的应用
4.1 弹性蛋白材料
弹性蛋白材料可作为支架材料嫁接在血管上：这是因为该材料具有无毒、生物相容性良好的优点，并能有效地调节和重塑宿主细胞的增殖、分化。同时，体外研究证实，该支架材料可实现完全内皮化，有效防止血栓的形成。但是弹性蛋白材料却有着致命的缺点，它的极限抗张强度较小，因而容易断裂，为解决这一问题就需要与其它材料复合或对其改性以获得性能更好的材料。下面介绍的弹性—胶原蛋白材料就是这样的一种复合材料。
4.2 弹性蛋白--胶原蛋白复合材料
首先，弹性蛋白赋予了材料以恢复形变的能力，然后胶原蛋白提供张力支持，阻止了材料的破裂，克服了纯弹性蛋白材料抗张强度小的缺点。与单纯的胶原蛋白和弹性蛋白支架材料比较，该复合材料可通过改变弹性蛋白和胶原蛋白的比例来调节其力学性能，而获得满足小血管、心脏血管等不同力学环境要求的材料。此外胶原蛋白、弹性蛋白还能用于构建真皮基质膜。有人进行了这么一个试验，给烧伤的病人的手部移植了弹蛋白性真皮基质膜，3个月后移植区域具有良好的柔韧性，手掌可以全方位的活动，没有水泡或不稳定的伤疤出现。这表明了，胶原蛋白、弹性蛋白基质材料是一种性能很好的体内外损伤修补材料。
图5.弹性蛋白和胶原蛋白在组织中的分布
4.3 弹性蛋白其它材料
弹性蛋白还可与其它材料复合构建具有良好性能的生物医用材料。下面简要介绍3个例子。
第一个例子是弹性蛋白与聚二恶烷酮(Polydioxanone，PDO)复合构成支架材料。首先，他具有聚二恶烷酮的力学性能，再加上，弹性蛋白的弹性和生物相容性使得该支架的性能与天然动脉组织更加相近，且有益于组织重建。
第二个例子是将海藻酸钠、弹性蛋白、聚乙二醇混合制得多孔复合基体材料。这种基体材料的分级结构有利于受损伤的心肌细胞的修复。
第三个例子是将与小肠黏膜下层结合的弹性蛋白和氰基丙烯酸盐粘合剂用于修补十二指肠的损伤。动物实验证明：这种弹性蛋白补丁材料能够提供一个可靠的屏障来修复十二指肠的损伤，氰基丙烯酸盐粘合剂的作用是使补丁快速紧密地组织融合。
重组弹性蛋白
重组弹性蛋白：弹性蛋白是细胞外基质中一种重要的结构蛋白，同时由于其性质稳定、高力学强度、高生物活性等优点，在组织工程领域受到广泛关注。然而，天然弹性蛋白溶解性较差，获取难度大，且存在免疫原性化学合成法制备的弹性多肽，可以人为控制序列组成，并引入非天然氨基酸调控蛋白功能，但普遍存在分子量较小，且制备成本较高等问题，也不适用于大规模的医用材料制备。利用原核生物表达体系制备重组弹性蛋白，既可以一定程度上人为调控蛋白的序列，同时其分子量较大，此外还能够通过扩大发酵体系规模，从而实现批量化制备，目前被视为最理想的弹性蛋白医用材料的原料获取手段。
重组弹性蛋白制备流程
- 重组人弹性蛋白序列设计与质粒构建：
①目的基因选取：选取人弹性蛋白全长序列中的关键结构为基本单元，构建重组人源弹性蛋白RE(RecombinantElastin)。
②基因片段优化：在人源弹性蛋白序列中加入亲和标签，基因片段插入到带有卡那霉素/氨苄抗性基因的质粒，再将包含有目的基因的片段导入工程菌中。
③高表达工程菌制备：对导入重组质粒的大肠杆菌进行筛选与扩大，获得高表达的重组人弹性蛋白的工程菌。
- 重组人弹性蛋白发酵培养：
①工程菌菌种复苏：取重组弹性蛋白工程菌种种子，室温下复苏。
②种子液培养：将复苏后菌种置于小摇瓶中，加入相应得培养基中适宜条件下进行培养。
③二级种子培养：将种子液按照一定比例转移至更大的摇瓶中进行扩大培养。
④发酵罐培养：将二级种子按照一定比例转移至发酵罐中进行培养。
注：优化重组人弹性蛋白的培养、发酵、诱导表达条件等，确定高效的诱导表达工艺，实现重组人弹性蛋白的表达。
- 重组人弹性蛋白的纯化：
①破菌：将菌体按一定比例加入破菌液，充分重选后，进行匀浆。
②离心、过滤：按照优化后的条件进行离心分离破菌上清和破菌沉淀，破菌上清过滤备用。
③特殊性质纯化：利用重组人弹性蛋白可逆相变特性，高温沉淀，低温溶解对目的蛋白进行纯化。
④金属螯合层析：利用基因设计中对应的金属螯合填料，对重组人弹性蛋白样品进行亲和层析，特异性结合后洗脱，达到纯化效果。
⑤离子柱层析：根据目的蛋白等电点性质，合理设计离子柱层析条件，通过重组人弹性蛋白与层析柱的结合洗脱性质，达到纯化效果。
⑥超滤换液：利用超滤模具，对样品进行换液，从而将重组人弹性蛋白置换到适合的储存液中，以便后续分装保存。
展望
人类的进步与医学水平的进步密切相关。近年来，受新冠疫情影响，医用材料领域的相关研究受到越来越多的关注。弹性蛋白形成的分子支架材料，具有良好的生物活性与较高的机械强度，因此，重组弹性蛋白的仿生设计在制备新型生物材料领域具有广阔的应用前景。在本工作的基础上，我们可以进一步发掘重组人弹性蛋白在医用材料方面的应用价值，主要包括：
设计分子量更接近全长序列的重组弹性蛋白，并通过优化表达条件，构建高效的重组弹性蛋白的制备方法。
利用弹性蛋白可逆相变的特征性质，开发以弹性蛋白作为相变纯化标签的融合蛋白纯化体系。
结合本工作中积累的弹性蛋白交联研究经验，开发广谱性的弹性蛋白交联剂，能够交联各种来源、不同链长的弹性蛋白，并深入探究具有各种力学特性的弹性蛋白材料的制备工艺，以拓展弹性蛋白在人造器官、3D打印等新型组织工程材料领域的应用空间。
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