快速AST：控制扩散离心微流控技术的应用

快速AST：控制扩散离心微流控技术的应用

抗生素滥用已成为全球公共安全问题，快速抗菌药物敏感性试验（AST）的发展对抑制抗菌素耐药性至关重要。华中科技大学刘笔锋教授团队提出了一种新型控制扩散离心微流控平台（CCM），该平台能在3分钟内生成抗生素浓度梯度，并通过离心混合溶液和细菌悬浮液，在4-9小时内获得精确的MIC值。

抗生素滥用已成为全球公共安全问题，促进了致抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的发展；快速抗菌药物敏感性试验（AST）的发展对抑制AMR至关重要。然而，传统AST方法耗时（24-72小时）、劳动密集且成本高。微流控技术，特别是基于扩散的浓度梯度微流控（Diffusion-based Concentration Gradient Microfluidics, DCG），为快速AST提供了一个有前景的解决方案。基于此，华中科技大学刘笔锋教授团队提出了一种新型控制扩散离心微流控平台（CCM），该平台能在3分钟内生成抗生素浓度梯度，并通过离心混合溶液和细菌悬浮液，在4-9小时内获得精确的MIC值。联合自主研发的集成移动检测平台，进一步提高方法自动化及测试的实用性和准确性（图1）。

该CCM平台由四层聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）组成，具体结构包括：3个进样口（用于抗生素、缓冲液、细菌的输入）、分液室（用于形成抗生素梯度）、气动阀、外围反应室（细菌与抗生素溶液的混合、反应及结果观察）。实验时，首先将细菌样本溶液加入到内环通道的1号进样口，然后将抗生素及缓冲液分别加入到2号和3号进样口的主微通道中，在主微通道中，两种试剂基于控制扩散的原理生成浓度梯度（这一阶段总耗费时间共3 min）。然后，通过离心（3000 rpm，10 s），将前面加载的试剂和细菌样本依次注入最外层的反应室混合。孵育固定时间后，在此观察细菌生长情况以完成MIC值判定。另外，作者引入检测试剂（WST-8）【实验时首先与细菌样本混合】指示细菌的活性以实现结果的可视化。作为例证，作者以宋内氏志贺氏菌为目标菌，卡那霉素（KAN）、链霉素（SM）和庆大霉素（GM）为目标抗生素探索了方法的可行性。以KAN为例（浓度梯度：6 μg/mL到11 μg/mL），8小时内CCM界定的MIC值为10 μg/mL，与传统的肉汤稀释法（16-20 h）界定值（5到10μg/mL）一致（图2）。进一步，作者引入2例尿液感染样本（样本号：A1325和A1232）评价CCM的实际应用能力。测定结果均与肉汤稀释法保持一致。最后，为了减少肉眼判断带来的主观误差，研究团队开发了集成移动检测平台（IMDP），该平台能在3分钟内自动完成结果的可视化，且其判定的AST结果与Image J软件分析结果一致（图3）。

总的来说，本研究开发的CCM平台设计巧妙，操作简便。联用自开发的IMDP，动态监测细菌生长并上传数据至移动设备，提高测试结果的准确性，降低成本，不失为一个精妙的快速AST方案。不过，本研究在自动化水平上还有欠缺，未来工作将致力于进一步优化平台，加入温度控制等功能，以实现全流程自动化的抗菌性检测。

图1 工作流程图

图2 宋内氏志贺氏菌与KAN共培养的实验结果。（A）反应开始后1h、6h、7h和8h的图像。（B）在1-8小时内，每个腔室的灰度值变化图（n = 3次重复）。（C）96孔板肉汤稀释法的MIC值界定结果。（D）8小时所有腔室的显微镜图像。

图3 使用IMDP读取AST结果的示意图。（A-B）IMDP的真实图像和原理图。(C)IMDP采集的数据与Image J的数据比较

原文参考：Zheng Pang, Shunji Li, Shangang Wang, Zonglin Cai , Shuo Zhang , Chao Wan , Jieqing Wang , Yiwei Li, Peng Chen, Bi-Feng Liu*. Controlled-diffusion centrifugal microfluidic for rapid antibiotic susceptibility testing. Analytica Chimica Acta 1287 (2024) 342033*