手把手教学｜一文带你探索免疫组化

手把手教学｜一文带你探索免疫组化

免疫组化技术在癌症诊断、新药研发以及探索疾病机理等领域具有广泛应用。本文将详细介绍免疫组化技术的原理、实验流程、图片解读以及常见问题的解决方案。

现如今，免疫组化技术因其在癌症诊断、新药研发以及探索疾病机理等领域的广泛应用而显示出显著的重要性。它不仅能够精确识别和定位组织样本中的特定蛋白质，还能帮助医生更好地理解肿瘤的性质和行为，从而指导治疗方案的选择。此外，在新药开发过程中，通过免疫组化分析药物靶点的表达和活性，科学家可以评估药物的功效和安全性，加速药物从实验室到临床的转化。
因此，深入理解免疫组化的原理显得至关重要。具体来说，这项技术利用特制的抗体搜索目标蛋白质。抗体能够精确识别并结合到特定的蛋白质上，其原理类似于钥匙与锁的匹配。在实验过程中，这些抗体被附加上能够发光或变色的标记物，因此当抗体与其目标蛋白质结合时，相应的区域便会亮起或变色。借助显微镜，研究人员便能观察到这些标记，从而准确了解蛋白质在组织中的位置和分布。

简言之，免疫组化技术就像是一场精彩的“寻宝游戏”，帮助科学家在细胞的复杂环境中寻找并观察关键的“宝藏”——蛋白质。这种技术对于揭示健康与疾病的生物学基础具有至关重要的作用。
那么如何才能做好免疫组化呢，下面就跟着笔者一起来梳理免疫组化的过程吧~
一、实验流程
1. 石蜡切片脱蜡
目的：移除切片中的石蜡，因为石蜡会阻碍抗体和组织的接触。
方法：使用二甲苯脱蜡，每次20分钟，共3次。这能彻底清除组织切片中的石蜡。
2. 梯度酒精脱水至水
目的：渐进地从高浓度酒精到水，有助于渐进地重新水合组织，减少细胞和组织结构的损伤。
方法：分别用100% 酒精处理5分钟×2次，接着使用95%, 90%, 85%, 75% 酒精各5分钟，最后用蒸馏水平衡1分钟。
3. 阻断内源性过氧化物酶
目的：因为过氧化物酶可以催化底物（如DAB）产生色素，从而导致非特异性染色。H₂O₂可以氧化过氧化物酶中的铁离子，从而破坏其催化活性，防止内源性过氧化物酶导致的背景染色。
方法：使用3%的H₂O₂溶液于摇床上处理10分钟。（用一句话概括，即低浓度，长时间~）
4. PBS清洗
目的：去除前一步骤中的化学剂，减少干扰。
方法：使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，每次5分钟，共3次。
5. 抗原修复
目的：恢复组织切片中被固定过程中改变的抗原结构，提高抗体的识别率。高温可以帮助断开蛋白质间的交联键（尤其是甲醛引起的交联），从而恢复抗原的原始结构和暴露被掩盖的抗原表位。或者通过使用特定的酶（如胰蛋白酶、蛋白酶K或胃蛋白酶）处理组织切片，以裂解蛋白质之间的肽键，解开蛋白质交联并暴露抗原表位。
方法：使用0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA（pH 9.0）在微波中加热抗原修复，功率450W，分配时间为3分钟、3分钟、4分钟或5分钟、5分钟；随后在室温下晾凉。再次使用PBS清洗，每次5分钟，共3次。
（根据实验要求，也可选择使用胰酶、胃蛋白酶进行修复，或使用高压锅进行抗原修复。）
6. 封闭非特异性结合
目的：防止抗体非特异性地结合到组织上，降低背景染色。
方法：封闭40分钟至一小时，可使用牛血清白蛋白、与二抗同种属血清、羊血清、5%羊血清+BSA或5%脱脂奶，根据具体实验条件调整。
7. 一抗孵育
目的：允许一抗特异性地结合到目标抗原上。
方法：加入一抗，放入湿盒中在4℃下过夜孵育。
8. 室温复温和PBS清洗
目的：将样本温度调节到适合进行下一步实验的室温。
方法：次日将湿盒取出，室温下复温20-30分钟，然后用PBS溶液洗涤，每次5分钟，共3次。
9. 二抗孵育
目的：二抗结合到一抗上，通常标记有易于检测的酶（如辣根过氧化物酶，HRP）或荧光团。
方法：加入二抗，于室温下在湿盒中孵育20分钟（根据所用二抗的建议孵育时间调整）。再次使用PBS清洗，每次5分钟，共3次。
注意：一定要选对二抗！原则是二抗必须针对一抗的宿主种属。例如，如果一抗是由小鼠产生的，那么二抗应该是针对小鼠抗体的抗体（如羊抗小鼠IgG）。
10. DAB显色
目的：当DAB与HRP反应时，会生成一种棕色的不溶性产物。这种产物在组织切片上形成沉淀，准确标记了抗体绑定的位置。
方法：使用DAB显色，注意观察，通常不超过3-5分钟。
11. 苏木精复染和盐酸-酒精分色
目的：苏木精是一种碱性染料，主要与细胞核中的酸性成分（主要是DNA）结合，增强细胞核的对比度，而盐酸-酒精分色则用来优化和平衡染色结果，避免过度染色，确保图像的清晰度和对比度，改善图像质量。
方法：苏木精复染1分钟，盐酸-酒精分色数秒。
12. 流水返蓝
目的：中和过度染色，调整色彩平衡。
方法：通常使用自来水返蓝30分钟，温水条件下可缩短至15分钟。也可使用市售返蓝液或EDTA修复液，观察到切片呈蓝色时即可停止，通常耗时数秒至2分钟。
13．梯度酒精脱水：
目的：移除组织切片中的水分，为下一步的二甲苯透明处理做准备。水分和二甲苯是不相容的，因此必须彻底去除水分，以保证二甲苯能有效作用。
方法：顺着之前的流程反向走一次，但每步骤仅需数秒。
14．二甲苯透明处理：
目的：清除组织中的残留酒精，使组织成为透明状态，以便更好地进行封片处理。
15.中性树胶封片：
目的：固定组织在载玻片上，提供物理保护，并防止化学和生物的降解，以保持切片长期保存。
方法：注意使用适量的中性树胶，一滴即可。
二、免疫组化图片解读

上图是我做的肿瘤Ki67的表达情况，对于阳性标记的定性判断，以DAB标记为例，颜色深浅程度可以作为评价标准之一。通常情况下，阳性标记的颜色由浅到深呈现为浅黄色、棕黄色和棕褐色粗颗粒。根据颜色深浅的变化，可以将评分细分为：0分表示阴性，即没有出现黄色；1分表示阳性，表现为浅黄色；2分表示阳性，表现为棕黄色；3分表示阳性，表现为棕褐色。而针对阳性标记的定量判断，可在低倍镜下观察阳性细胞的密度。密度的判断依据是阳性细胞占总细胞数的比例。具体分数划分如下：如果阳性细胞占总细胞数的比例为25%或更少，则评分为1分；如果比例在26%至50%之间，则评分为2分；如果比例在51%至75%之间，则评分为3分；如果比例达到76%至100%，则评分为4分。
三、免疫组化常见问题解码
1.背景颜色过高
免疫组化背景颜色过高是我们在实验过程中很常见的问题，抗体（一抗或二抗）使用的浓度过高会增加非特异性的结合；样本中的非特异性结合位点没有被充分阻断；洗涤步骤不充分会导致未结合的抗体残留在组织切片上；过度固定或固定不足都可能影响抗原的暴露和抗体的结合特性；使用的抗体如果特异性不高；抗原回收（如高温、高压或酶处理）如果过度进行都会导致非特异性染色，那么该如何解决以上问题呢~

首先需尝试使用更低的抗体浓度，并进行滴度测试以找到最佳浓度；

也可以增加洗涤次数或延长每次洗涤的时间，确保充分去除未结合的抗体；

或者进行负对照实验，不添加一抗而只添加二抗，以评估非特异性结合的程度。
2.信号弱或者无信号

检查和调整一抗和二抗的稀释比例，可能需要进行一系列滴度实验，以找到产生最佳信号与背景比的浓度；

增加抗体（特别是一抗）的孵育时间；

加强阻断步骤以减少非特异性结合；

如果使用的是酶联二抗，可以考虑换用更敏感的检测系统。
3.染色不均

使用适当的固定剂（通常是4%的甲醛）和正确的固定时间。过度或不足的固定都可能影响染色的均匀性；

在应用抗体和其他试剂时，确保液体均匀覆盖整个切片。避免滴加试剂时直接冲击到切片，这可能导致局部浓度过高或过低。

本文原文来自360doc.com