诺贝尔得主揭秘：限制酶如何改变世界
诺贝尔得主揭秘：限制酶如何改变世界
1978年，诺贝尔生理学或医学奖授予了三位科学家：Werner Arber、Hamilton Smith和Daniel Nathans。他们的发现不仅揭示了细菌的防御机制，更为基因工程提供了关键工具——限制性内切酶，被誉为“分子剪刀”。
限制酶：细菌的防御利器
限制酶是一种能够识别并切割双链DNA特定序列的酶。其作用机制主要包括以下几个关键点：
特异性识别：限制酶能识别DNA上的特定核苷酸序列，这些序列通常为4-8个碱基对组成的回文结构。
磷酸二酯键断裂：一旦识别到目标序列，限制酶会在特定位置切断DNA双链中的磷酸二酯键，从而将DNA分子分开。
产生末端类型：
- 黏性末端：部分限制酶在非对称位置切割两条链，形成具有互补单链突出的末端。
- 平末端：另一些限制酶在对称位置切割，产生无突出的平整末端。
基因工程的关键工具
限制酶在基因工程中的应用极为广泛，其中最具代表性的就是Cre-loxP系统。这是一种利用限制酶原理进行基因编辑的技术。
Cre-loxP系统利用Cre重组酶和loxP位点来对基因组进行精确的修饰。Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够识别并切割loxP位点。LoxP位点长为34bp，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，反向回文序列是Cre重组酶的识别和结合区域，间隔序列决定LoxP序列的方向。
Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，大致分成三种情况：
- 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列
- 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转
- 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位
最新进展：更安全高效的基因编辑
随着基因编辑技术的发展，研究人员正在开发更安全、高效的基因编辑载体。麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的David R. Liu团队开发了一种新的定向进化系统，通过该系统可以改善病毒样颗粒（VLPs）的属性，从而提高它们作为基因编辑传递载体的潜力。
该系统利用独特的条形码sgRNA标记每个eVLP变体，通过生产选择和转导选择实验，证明了条形码富集与所需属性的eVLP变体相关。在生产选择中，功能性Gag-ABE构建与非功能性ABE构建（无Gag）被用来生成含有不同条形码的eVLP，结果显示功能性构建的条形码在eVLP中富集，而非功能性构建的条形码则减少。在转导选择中，野生型VSV-G包膜蛋白与受损的VSV-Gmut包膜蛋白被用来评估eVLP对细胞的转导效率，结果显示野生型VSV-G的条形码在成功转导的细胞中富集。这些结果共同验证了条形码eVLP系统的有效性，并为进一步的eVLP进化和优化提供了基础。
研究人员构建了一个包含3,762个MMLV Gag蛋白衣壳突变体的条形码eVLP衣壳库，并进行了两个独立的筛选：一是提高生产效率，二是提高对HEK293T细胞的转导效率。通过高通量测序分析，研究者确定了在生产和转导筛选中富集的条形码，这些富集的条形码对应于支持改善eVLP性能的衣壳突变体。图中展示了所有衣壳突变体在生产和转导筛选中的平均富集值，其中红色点代表v4 eVLP的典型衣壳，蓝色点代表被选为进一步表征的突变体。这些结果揭示了不同衣壳突变对eVLP生产和转导效率的影响，并为开发具有提高性能的eVLP变体提供了重要信息。
研究者们首先将单个衣壳突变体分别引入Gag-ABE构建中，并与GagQ226P-Pro-Pol搭配，发现多种突变体相比v4 eVLPs在效力上有所提升。进一步，研究者们测试了不同组合的突变体在Gag-ABE和Gag-Pro-Pol中的搭配效果，发现特定的C末端突变体与GagQ226P-Pro-Pol搭配时表现出最佳的效力。通过在不同剂量下评估这些eVLP变体在HEK293T细胞中的腺嘌呤碱基编辑效率，确认了v5 eVLPs（特别是GagC507V-ABE + GagQ226P-Pro-Pol组合）在效力上实现了2至4倍的提升。此外，研究还证明了这些改进的eVLP变体能够提高在小鼠N2A细胞中的基因编辑效力，证实了v5 eVLPs在不同细胞类型中的改进性能。
通过比较v4和v5 BE-eVLPs在不同剂量下的效果，研究发现v5 BE-eVLPs在所有测试剂量下均显示出比v4 BE-eVLPs更高的目标腺嘌呤碱基编辑效率，平均提高了2.6倍的效力。特别是在最高测试剂量下，v4 BE-eVLPs达到的最大编辑效率可以通过使用16倍更低剂量的v5 BE-eVLPs实现。此外，与未处理的HSPCs相比，经v4或v5 eVLPs处理后48小时的总活细胞数没有显著差异，表明eVLPs对HSPCs的活力没有显著影响。这些结果进一步证明了v5 eVLPs在治疗相关细胞类型中的改进性能和应用潜力。
研究发现，v5 eVLPs中的Q226P和C507V突变导致了更高效的货物释放和更多的ABE蛋白及sgRNA分子的包装，这可能有助于提高其转导效力。冷冻电镜图像显示，与v4 eVLPs相比，v5 eVLPs的衣壳结构发生了显著变化，缺少成熟的衣壳形态，表明成熟的衣壳对于eVLPs传递BE RNP货物并非必需。此外，v5 eVLPs的颗粒直径略大，这可能使它们能够每个颗粒包装更多的货物分子。这些结构和组成的变化共同促成了v5 eVLPs相比v4 eVLPs在功能上的提升。
这项研究不仅展示了eVLPs在基因编辑和治疗蛋白传递中的潜力，也为未来设计更高效、安全的基因编辑工具提供了新策略。随着技术的不断进步，限制酶及其衍生技术必将在生命科学研究和医疗领域发挥越来越重要的作用。