干细胞诱导人造血液成分研究新进展
干细胞诱导人造血液成分研究新进展
血液成分供应不足以及特殊血型的稀缺使得人们对体外人造血液产品始终寄予期待和厚望。其中一种方法是使用脂质体等人工材料，制造出模仿红细胞或血小板功能的颗粒。另一种方法是从干细胞，特别是诱导多能干细胞（iPSCs）分化出血细胞，同时不断尝试将基因编辑技术融入血细胞研发的应用中。本文将介绍干细胞诱导人造血液成分及CRISPR修饰红细胞的研究新进展。
利用人类多能干细胞生成红细胞的最新进展
红细胞输血对于患有贫血和血红蛋白疾病等红细胞功能不全的患者以及现代医疗实践（如手术和癌症治疗）至关重要。然而，献血者短缺和输血相关的风险仍然是关键挑战。因此，研究人员提出了体外生成红细胞的方法作为一种可行的替代方案。过去的研究使用成人和脐血中的造血干细胞和/或前体细胞来生成红细胞。然而，这种来源是有限的和不可持续的。相比之下，人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs），包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），由于其自我更新能力，为红细胞提供了无限的供应可能。
从hPSCs中分化出红细胞可以重现红细胞生成的关键事件，即造血干细胞和/或前体细胞向红细胞系分化的过程。因此，许多研究尝试开发逐步的分化方案。
研究者们通过向hPSCs提供合适的微环境或生态位以及对与红细胞生成机制相关的生长因子、细胞因子和小分子进行顺序处理来调节红细胞生成。hPSCs生成红细胞的过程可以通过不同的方法和技术来实现。一些关键步骤和技术包括：
hPSCs的培养和扩增：将hPSCs放置在预先涂覆有胶原或基质的培养皿中，并在恒定的温度和湿度下培养；通过定期传代，增加培养皿数量或自动化培养系统等扩增hPSCs的数量。
血细胞前体细胞的诱导（生成红细胞的关键步骤）：通过使用特定的生长因子和细胞因子的组合，如干细胞因子（stem cell factor，SCF）、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、白细胞介素3和6（IL3和IL6）等，将hPSCs分化为血细胞前体细胞（CD34 + HSPCs）。
红细胞的分化和成熟：通过使用不同的培养系统和培养基，如使用鼠源性MS5饲养层细胞、胎肝来源的基质细胞或人类血浆等进行培养和处理使血细胞前体细胞可以分化为红细胞。
红细胞的特性和功能验证：生成的红细胞需要进行特性和功能验证，以确保其具有正常的生理。
虽然由此产生的hPSCs衍生的红细胞表现出人类红细胞的某些特征，但要投入临床应用仍存在一些局限性。首先，目前的红细胞生成方法尚未能够实现大规模的生产。其次，红细胞的成熟过程中需要β珠蛋白的稳定表达以及脱核过程（enucleation），但目前从hPSCs生成的红细胞的脱核效率较低，平均脱核化率不到10%。此外，红细胞的功能和特性与体内自然产生的红细胞可能存在差异，这可能会影响其在临床上的应用效果。
未来，hPSCs生成的红细胞的发展方向包括提高生产效率和红细胞的脱核效率。研究人员可以探索新的培养条件和因子，以促进红细胞的生长和成熟。此外，研究人员还可以进一步研究红细胞的功能和特性，以确保其与体内自然产生的红细胞相似。这些努力将有助于推动hPSCs生成的红细胞在临床应用中的发展。
文献来源：LEE S J,JUNG C,OH J E,et al. Generation of red blood cells from human pluripotent stem cells-an update[J]. Cells,2023,12(11):1554.
使用CRISPR/Cas9体系制造RhD阴性血液
研究背景
血液供应短缺，尤其是罕见血型的短缺，对当前的医疗系统构成威胁。O型RhD阴性血是通用的献血者血型，被认为是输血应用中有限而宝贵的红细胞来源。人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)的无限增殖潜力及其分化成三种生殖层细胞类型的潜力，为基于细胞的治疗和再生医学提供了巨大的机遇。从hiPSCs生产的红细胞可以成为输血的另一种细胞来源，其具有显著的临床实用价值。从O型hiPSCs分化出来的通用红细胞可以克服稀有血型患者血液短缺的问题。
研究方法
首先设计RHD特异性的指导RNA（guide RNAs，gRNAs），将gRNA克隆到Cas9表达载体中，生成pRHD-Exon 2-sgRNA-CRISPR-Cas9载体（质粒），同时将包含过早终止密码序列的RHD-外显子2左右同源臂克隆到GFP/嘌呤霉素表达载体中，得到pRHD-HL-stop-HR-donor-puro-GFP载体（质粒）。使用脂质体干细胞转染试剂，用500 ng CRIPSR/Cas9质粒（(250 ng pRHD-exon 2-sgRNACRISPR-Cas9 和 250 ng pRHD-HL-stop-HR-donor-puro-GFP）转染HuAiPSC-A1细胞（40%-50%）（如图）。由此得到HuAiPSC-A1-RHD -/-细胞系。
将HuAiPSC-A1-RHD -/-细胞系分化为造血干/祖细胞，然后在氧浓度优化的分化方案中进一步分化为红细胞。这一过程主要包括四个阶段：
（I）中胚层的诱导；
（II）造血内皮生成；
（III）造血细胞的出现和红细胞的分化；
（IV）红细胞的成熟。
本研究在前三个阶段使用5%氧气浓度，而在最后一个阶段使用20%氧气浓度，可以获得更高的红细胞扩增效率和更成熟的红细胞。
得到的红细胞进行qRCR，流式细胞分析、荧光激活细胞分类、血清凝集试验以及血红蛋白功能测定。
研究结果和结论
研究人员利用基于同源定向修复（homology-directed repair，HDR）的CRISPR/Cas9技术开发了O型Rh D阴性hiPSCs。选择从人脐动脉内皮细胞分化而来并显示出造血分化倾向的HuAiPSCs进行基因修饰。得到了HuAiPSCA1-RHD -/-细胞系，该细胞系衍生的红细胞表达红细胞标记物CD71和CD235a。但这些红细胞不表达D抗原，在存在抗RhD试剂的情况下不凝集。
本研究的基因编辑策略及氧浓度优化分化方案生产红细胞的效率高，具有很大的临床应用潜力。
文献来源：XU L,ZENG Q,LIANG L Q,et al. Generation of Rh D-negative blood using CRISPR/Cas9[J]. Cell Prolif,2023,56(11):e13486.
PSCs体外产生血小板：iPLAT1研究及前景
介绍
由于血小板产品的保质期短(最多7天)、发达国家老龄化社会供需失衡以及异体免疫介导的血小板无效输血(allo-PTR)等原因，血小板产品的供应问题已经引起人们的关注。自体 iPSC 衍生血小板产品（iPSC-PLTs）的临床试验 iPLAT1 于 2019 年至 2022 年进行。本文将提供iPLAT1试验的概述，并讨论它对异体iPSC-PLTs、其他iPSC衍生的血细胞产品以及整个再生医学领域的影响。
内容
1. iPLAT1 临床试验的成就和局限性
iPLAT1试验设计为单中心、开放标签、无对照的自体iPSC-PLTs剂量递增研究(图1)。受试者是一名再生障碍性贫血患者，患有由抗人类血小板抗原（HPA）-1a 抗体引起的allo-PTR。对患者进行了自体输注 iPSC-PLTs 的临床试验（3 次剂量依次递增，分别为 1 × 1010、3 × 1010 和 1 × 1011）。
结果表明：患者对输血的耐受性良好，随访一年未发现明显并发症。然而，即使输注了最后的最大剂量，患者的血小板数量也没有明显增加。这可能是由于医院使用的细胞计数器无法检测到较大尺寸的 iPSC-PLTs；或者iPSC-PLTs 可能在输血后 2-6 小时才达到峰值。
图1 iPLAT1试验流程
2. 可持续增殖和扩张的巨核细胞（MKs）作为生产血小板的主细胞
将特定基因组引入 iPSC 或 iPSC 衍生细胞，使其分化成可持续增殖和扩张的巨核细胞（例如：imMKCLs）。与iPSCs相比，使用永生化巨核祖细胞系（imMKCLs）作为主细胞可以缩短体外血小板生产的过程。
然而，与能产生800-2000个血小板的内源性MKs相比， imMKCLs的血小板生产率仅为每个巨核细胞产生100个血小板。这可能是由于iPSC衍生的细胞表现出非成人特征所导致的。与成人特征的MKs相比，非成人特征的MKs产生的血小板数量更少。
3. 用湍流生物反应器、新型试剂和封闭式包装工艺生产iPSC-PLTs
在使用多西环素、干细胞因子和血小板生成素模拟物 TA-316 进行 21 天 DOX-ON 扩增培养后，将 imMKCLs 重新悬浮到 DOX-OFF 培养基中，该培养基不包括多西环素。
由于湍流能促进血栓形成， DOX-OFF 培养在湍流式往复垂直运动生物反应器 VerMES 中进行。DOX-OFF 培养后，使用中空纤维、ACP215离心机和去白细胞过滤器对培养液中的iPSC-PLTs进行分离、洗涤和浓缩。随后将约 10×1011 个 iPSC-PLTs 装入含 20% 酸柠檬酸葡萄糖和 2.5% 人血清白蛋白的重碳酸林格氏溶液的血袋中。
最后，血袋接受25Gy射线照射，以消除任何剩余的有核细胞的致瘤性。
4. iPSC-血小板的非临床研究证明了安全性、有效性和质量
已经对iPSC-PLTs的安全性进行了全面的非临床研究。生产系统符合良好生产规范（GMP）标准；起始材料imMKCLs主细胞库（MCB）不含致病微生物；制造iPSC-PLTs的材料符合生物原料标准；细胞培养制造过程中的添加剂是非遗传毒性的。
此外，已经通过小鼠单次剂量试验和大鼠单次/多次剂量试验对iPSC-PLTs的安全性进行了评估。iPSCs、DOX-ON 条件下的 imMKCLs 以及最终的 iPSC-PLTs 制剂在 25 Gy（输血产品用于预防 GVHD 的常用剂量）辐照下不会致瘤。
在质量和疗效方面，与献血员来源的血小板（2μm）相比，iPSC-PLTs 的直径更大（4μm），未成熟血小板含量更高。但电子显微镜观察结果显示：两种血小板具有相似的内部结构。
5. iPSC-PLTs同种异体产品的开发及非输血应用
鉴于大多数allo-PTR主要是由抗HLA I类抗体引起的，具有广泛的HLA相容的、可用于再生医学的纯合子的HLA-iPSCs将是合适的来源。基于iPSC对基因编辑的适应性，正在开发去除HLA I类抗体的iPSC-PLTs。这将是一种通用产品，理论上应在很大程度上避免异体 PTR 的排斥反应并防止其发展。
此外，人类白细胞抗原基因敲除的iPSC-PLTs也可以作为药物输送系统、富含血小板血浆(PRP)治疗或其他非输血目的的基础材料。
结论
从多能干细胞衍生出 MKs 和血小板，推动了造血领域的许多基础研究进展，如今已接近临床应用。如图 2 所示，基于实验室的基础开发、GMP 的生产系统的建立、所需的大量非临床评估的完成，以及与监管机构的协商，iPLAT1 研究得以实施。该试验证实，在没有兼容的实用血小板产品的allo-PTR患者中使用该产品是安全的。同时，它也揭示了循环能力和体内动物模型的不确定性，以及建立 imMKCLs 在成本和疗效方面的局限性。
这项研究是 iPSC-PLTs 临床应用的一个重要里程碑，为同种异体产品照亮了道路，并基于其潜在优势，使输血医学更加完善。它还将为再生医学领域做出贡献，提供祖细胞作为主细胞的生产系统蓝图，并开创针对各种非输血用途的新型血小板产品。
图 2 iPLAT1 研究的概述
参考来源：
SUGIMOTO N,ETO K. Ex vivo production of platelets from iPSCs:the iPLAT1 study and beyond[J]. Hemasphere,2023,7(6):e884.