PCR实验成功的关键：8个引物设计原则详解

PCR实验成功的关键：8个引物设计原则详解

引用

丁香园

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https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/50418740

PCR（聚合酶链式反应）实验的成功与否，很大程度上取决于引物设计的合理性。本文总结了8个关键的引物设计原则，从长度、GC含量、熔解温度到二级结构等各个方面，为科研人员提供详细的指导。

1. 引物长度

引物的长度通常在18-30个核苷酸（nt）之间，最常用的是20nt左右。上下游引物的长度最好基本相等，最多相差不超过3个碱基对（bp）。过短的引物容易导致非特异性扩增，而过长的引物虽然特异性较好，但容易在引物内部形成二级结构，如发夹环。

2. 引物GC含量

理想的GC含量范围是40-60%。GC比例过低会影响扩增效果，而GC比例过高则容易产生非特异性条带。此外，ATGC应该随机分布，避免出现重复的基序。

3. 引物的熔解温度

引物的熔解温度（Tm）应该在55-75℃之间，退火温度需要比解链温度低5℃。引物对之间的Tm差异应不超过2-3℃。对于短于20个碱基的引物，可以使用以下简化公式估算Tm：

4. 引物扩增跨度

普通PCR的扩增跨度以200-500bp为宜，而实时荧光PCR则建议控制在70-150bp之间。

5. 引物的二级结构

引物设计时最好跨内含子设计，以避免出现发夹结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响。

6. 碱基的随机分布

引物设计中四种碱基的分布应保持随机性，避免设计包含5个或更多连续相同碱基的引物，如AAAAAAAA或CCCCCCCC。同聚物串可能导致非特异性扩增，并且可能在PCR过程中形成发夹结构或二聚体。

7. 避免连续4个碱基的互补

引物自身或引物之间不应存在连续4个碱基以上的互补，以防止形成稳定的二聚体。特别要注意引物的3'端，因为DNA聚合酶在3'端容易出错，如果3'端存在互补序列，可能导致非特异性扩增。

8. 5'端可修饰，3'端不可修饰

5'端修饰的常见目的：

• 标记与检测：在5'端添加荧光标记或其他标签，便于扩增子的检测和分析。
• 引入限制性酶切位点：为了将扩增的片段克隆到特定的载体中，可以在5'端添加限制性酶切位点序列。
• 引入突变：在5'端设计引物时，可以引入特定的点突变，用于构建突变体或进行定点突变实验。
• 增加引物的Tm：通过在5'端添加G或C碱基，可以提高引物的Tm值，有助于提高PCR的特异性。
• 提高引物的溶解度：有时在5'端添加一些非特异性的序列，可以提高引物在水中的溶解度。

3'端修饰的注意事项：

• 稳定性：3'端的稳定性对PCR扩增至关重要，因为DNA聚合酶在3'端添加核苷酸。如果在3'端引入修饰，可能会影响DNA聚合酶的延伸效率。
• 非特异性扩增：3'端修饰可能增加非特异性扩增的风险，因为修饰可能改变引物与模板DNA的配对方式。
• 错配容忍度：DNA聚合酶对3'端的错配容忍度较低，修饰可能会影响引物的特异性。
• 延伸效率：3'端的修饰可能影响DNA聚合酶的延伸效率，导致PCR产物的产量降低。