不同部位鱼腥草多糖的结构表征与生物活性

不同部位鱼腥草多糖的结构表征与生物活性

鱼腥草，又名折耳根、狗心草，是一种常见的药食同源植物。其全株富含营养价值，不仅可作为蔬菜食用，还具有清热解毒、消痈排脓等功效，被誉为“中药抗生素”。近年来，关于鱼腥草多糖的研究主要集中于入药部分，而对其不同部位多糖的结构与生物活性差异的研究尚不充分。本研究采用水提醇沉法分别提取鱼腥草地下茎、茎和叶中的多糖，对其化学成分、分子质量、单糖组成等进行分析，并测定其体外抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性，以期为鱼腥草多糖的构效关系研究提供理论依据。

材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）样品来自湖北省宜昌市当阳市两河镇，经农户晒干后提供。样品经湖北中医药大学药学院鉴定。

1.2 设备与仪器

研究中使用了多种精密仪器，包括真空冷冻干燥机、酶标仪、离子色谱系统、激光光散射仪、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱仪等。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取与分离

采用水提醇沉法分别制备鱼腥草地下茎、茎和叶的粗多糖。具体步骤包括：将干燥的鱼腥草各部位粉碎过筛，以料液比1∶20，提取温度95℃，提取时间2h的条件提取2次，提取液离心后合并上清液，加入4倍体积的无水乙醇在4℃下静置过夜。过滤取沉淀，并用无水乙醇清洗沉淀3次以除去部分小分子物质，得到粗多糖。将粗多糖配制成8mg/mL溶液，用Sevag法除蛋白6次，旋转蒸发除去残留的有机试剂。将样品溶液装入透析袋中，用纯水透析2d，收集后冻干得到鱼腥草地下茎多糖（RHCP）、鱼腥草茎多糖（SHCP）和鱼腥草叶多糖（LHCP）。

1.3.2 成分组成测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖中中性糖含量；采用间羟基联苯法测定多糖中酸性糖含量；采用考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质含量；采用福林酚法测定游离酚和结合酚含量。

1.3.3 分子质量测定

采用GPC-MALS系统测定分子质量，使用Shodex-OHpak SB-806 HQ色谱柱，并配备TSK gel PWxL保护柱。

1.3.4 单糖组成分析

采用离子色谱系统对单糖组分进行分析检测。

1.3.5 红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱仪对多糖进行红外光谱分析。

1.3.6 乙酰基含量测定

采用碱性羟胺溶液和HCl溶液反应，通过紫外分光光度法测定乙酰基含量。

1.3.7 甲酯基含量测定

采用乙醇氧化酶法测定甲酯基含量。

1.3.8 扫描电镜分析

采用扫描电镜观察多糖的表面形态。

1.3.9 刚果红试验

通过刚果红与多糖的络合反应，检测多糖的三螺旋结构。

1.3.10 体外抗氧化活性研究

采用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP法测定多糖的抗氧化活性。

1.3.11 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

采用α-葡萄糖苷酶抑制试验测定多糖的降糖活性。

1.4 数据分析

采用GraphPad Prism 8.4软件进行数据处理和方差分析，P＜0.05表示差异显著。红外谱图利用Origin 2021软件绘图，其它使用GraphPad Prism 8.4软件绘图。

结果与分析

2.1 成分组成分析

表1显示了RHCP、SHCP和LHCP的化学成分。结果显示，RHCP与其它两种多糖在中性糖含量上存在显著差异，RHCP中中性糖含量最高，为32.39%，SHCP和LHCP中中性糖含量分别为28.12%和28.95%；三者的酸性糖含量无显著差异，分别为51.85%、52.23%和52.80%；三者的蛋白含量也无显著差异，分别为1.37%、1.59%和1.34%；而RHCP与SHCP和LHCP的结合酚与游离酚含量存在显著差异，LHCP中游离酚与结合酚含量最高，分别为1.27%和2.60%。结果表明，鱼腥草不同部位的多糖均为酸性多糖，其中RHCP的中性糖含量最高，LHCP的结合酚与游离酚含量最高。

2.2 单糖组成分析

表2显示了3种多糖的单糖组成。结果显示，3种多糖所含单糖种类一致，均由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸以及少量的岩藻糖、甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸组成，但比例有所不同。RHCP和SHCP各单糖中葡萄糖含量最高，而LHCP各单糖中半乳糖醛酸含量最高。与RHCP和SHCP相比，LHCP中阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖含量也较高。

2.3 分子质量分析

表3显示了鱼腥草各部位多糖的分子质量分布。结果显示，3种多糖均存在两个峰，说明3种多糖分子质量不均一，其中RHCP分子质量最大，主要组分有1.20×106u和3.88×105u，分别占比52.1%和47.9%。LHCP的分子质量次之，包括2.51×105u和4.97×104u两个组分，分别占比43.9%和65.1%。SHCP的分子质量最低，主要有47.6%的1.31×105u组分和52.4%的4.11×104u组分。

2.4 红外光谱分析

图1显示了3种多糖的红外谱图。结果显示，3种多糖都显示出相似的红外特征吸收峰，3408cm-1和2918cm-1处的峰是多糖的特征峰；1628cm-1和1422cm-1处的峰为羧基特征峰，表明多糖中含有糖醛酸。1740cm-1和1239cm-1处的峰的吸收峰为乙酰基或者羧酸酯中C=O的特征峰。1101cm-1和1021cm-1处的峰为吡喃糖环上C-O-C的伸缩振动吸收峰，887cm-1处的峰说明多糖中含有β-构型的糖苷键。结果表明鱼腥草各部位多糖均含有糖醛酸，存在吡喃糖环构型和β-构型的糖苷键。与RHCP和SHCP相比，LHCP在1740cm-1和1239cm-1处的峰强较强，可能表明3种多糖中，LHCP含有较多的酯基基团。

2.5 乙酰基与甲酯基含量分析

表4显示了RHCP、SHCP和LHCP的乙酰基与甲酯基含量。结果显示，RHCP、SHCP和LHCP的乙酰基和甲酯基含量存在显著性差异，RHCP的乙酰基和甲酯基含量最低，分别为0.36%和0.75%。SHCP中乙酰基和甲酯基的含量分别为0.71%和0.96%，LHCP的乙酰基和甲酯基含量最高，分别为0.95%和1.05%。LHCP具有较多的乙酰基和甲酯基可能是由于其半乳糖醛酸含量较高。

2.6 扫描电镜分析

图2显示了RHCP、SHCP和LHCP的扫描电镜图。结果显示，3种多糖的表面形态均呈不规则的破碎的片状结构，而LHCP的碎片表面积最小。高倍镜下观察到3种多糖表面光滑平整、结构紧密，这一现象可能与半乳糖醛酸使多糖分子间作用力增大有关。

2.7 刚果红试验

图3显示了刚果红-多糖复合物在不同浓度NaOH溶液中最大吸收波长的变化。结果显示，刚果红的最大吸收波长为497nm，刚果红-RHCP复合物和刚果红-SHCP复合物的最大吸收波长均为509nm，发生了红移，表明这两者中存在三螺旋结构。NaOH浓度升高，碱性增强，破坏了多糖分子内和分子间氢键，使三螺旋结构解旋，表现为最大吸收波长降低。而刚果红-LHCP复合物的最大波长没有发生红移，表明LHCP中不存在三螺旋结构。

2.8 体外抗氧化活性

图4显示了RHCP、SHCP和LHCP的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力。结果显示，RHCP、SHCP、LHCP和阳性对照VC均具有一定的DPPH自由基清除能力，且呈现明显的剂量效应。其中，LHCP的DPPH自由基清除能力最强，当LHCP质量浓度为4mg/mL时，其DPPH自由基清除率达到88.05%。其次是LHCP，在质量浓度同为4mg/mL时，DPPH自由基清除率为67.11%，而SHCP在相同浓度下的DPPH自由基清除率为62.86%。

2.9 α-葡萄糖苷酶抑制活性

图5显示了RHCP、SHCP和LHCP的α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果显示，鱼腥草各部位多糖与阳性对照阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性。可以看出，鱼腥草各部位多糖的抑制能力不如阿卡波糖，但都具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性的潜力，且呈现出明显的剂量效应。其中LHCP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最为显著，在质量浓度为6mg/mL时，LHCP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为69.58%，而在相同浓度下，阿卡波糖的抑制率为80.83%，SHCP的抑制率为56.70%，RHCP的抑制率最低为44.68%。

结论

鱼腥草不同部位多糖的结构和生物活性存在差异。在结构上，3种多糖的单糖组成相同但比例不同；分子质量大小不同；乙酰基和甲酯基含量有显著差异；LHCP与RHCP和SHCP的空间构象存在差异。生物活性上，3种多糖中LHCP表现出最强的体外抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性。LHCP较强的体外抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性可能归因于其较高含量的半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和结合酚、较多的乙酰基和甲酯基基团，并且不存在三螺旋结构。此外，多糖的糖苷键类型和立体构型等也是影响其生物活性的重要因素，鱼腥草多糖结构与生物活性的关系仍需进一步探索。