人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA检测操作流程详解
人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA检测操作流程详解
人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于临床诊断的检测技术，它通过抗原与抗体的特异性反应来定量或定性检测样本中的HBsAg含量。以下是人乙型肝炎病毒表面抗原ELISA检测操作流程的详细解析：
实验准备
- 试剂盒与试剂准备
ELISA试剂盒通常包含多个组成部分，如包被抗体反应条、酶结合物、阳性对照、阴性对照、洗涤液（磷酸盐缓冲液PBS）、显色剂（TMB）A和B等。在实验前，需将所有试剂从冷藏环境中取出，置于室温下平衡约30分钟，以确保试剂达到最佳工作温度。同时，根据实验需要准备蒸馏水，用于稀释浓缩洗涤液。
仪器与设备
准备酶标仪、移液器（不同量程）、洗板机（或手动洗涤设备）、恒温箱、振荡器及磁力搅拌器等实验所需设备，并确保所有仪器处于良好工作状态。样本处理
根据实验要求，处理待测样本（如血清、血浆、细胞培养基等）。血清样本需自然凝固后离心分离上清；血浆样本需根据抗凝剂类型混合后离心；细胞培养上清液需离心去除颗粒和聚合物；组织标本则需切割、匀浆并离心收集上清。处理后的样本应尽快进行检测，如需保存，应置于-70℃冰箱中，避免反复冻融。
实验步骤
包被抗体与加样
ELISA实验的第一步是在微孔板上预先包被抗-HBs（抗乙型肝炎病毒表面抗体），形成固相抗体。随后，将待测样本加入到包被的微孔板中。每个反应孔中加入的样本量需根据试剂盒说明书进行精确控制，通常为0.05ml。同时，设置阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔，以便后续结果的判断。孵育与洗涤
将加入样本的微孔板置于37℃恒温箱中孵育一定时间（通常为30分钟），使样本中的HBsAg与固相抗体充分结合。孵育结束后，使用洗涤液彻底清洗微孔板，以去除未结合的物质和杂质。洗涤过程需重复多次（一般为5次），每次洗涤后需用吸水纸拍干微孔板。
加酶标抗体与再次孵育
向每个反应孔中加入酶标记的特异抗体（酶标抗-HBs），该抗体能与结合在微孔板上的HBsAg形成抗原-抗体夹心结构。再次将微孔板置于37℃恒温箱中孵育一定时间（通常为30分钟），使酶标抗体与HBsAg充分结合。孵育结束后，重复洗涤步骤，去除未结合的酶标抗体。显色与终止
向每个反应孔中依次加入显色剂A和B，轻轻振荡混匀后，将微孔板置于37℃恒温箱中避光显色一定时间（通常为10-15分钟）。在酶的作用下，底物TMB发生化学反应，生成有色产物，其颜色深浅与样本中HBsAg的含量成正比。显色结束后，向每个反应孔中加入终止液，终止显色反应，此时溶液颜色由蓝色变为黄色。比色与结果分析
使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。首先用空白孔校零点，然后依次读取各孔的OD值。根据试剂盒提供的标准曲线或标准品OD值与浓度的对应关系，将样品的OD值代入方程，计算出样品中HBsAg的浓度。通常，样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。
注意事项
试剂保存：试剂盒应置于2℃～8℃保存，避免阳光直射和高温。使用前需充分摇匀试剂，并避免不同批号试剂混用。
操作规范：实验过程中应严格遵守操作规程，避免交叉污染。加样时应使用一次性吸头，避免直接接触终止液和显色剂。
结果判断：结果判断应在规定时间内完成（通常为10分钟内），以避免颜色反应随时间变化而影响结果准确性。
样品处理：样本采集后应尽快进行检测，如需保存应置于-70℃冰箱中，避免反复冻融。检测前需对样本进行适当处理，如离心去除杂质等。
- 安全防护：实验过程中应注意个人防护，避免直接接触有毒或有害试剂。实验完成后，所有废弃物应按传染物处理标准进行处理。
通过上述操作流程的详细解析，我们可以清晰地了解人乙型肝炎病毒表面抗原ELISA检测的全过程。