微量离心管和细胞培养瓶的高压蒸汽灭菌方法及细胞培养操作指南

微量离心管和细胞培养瓶的高压蒸汽灭菌方法及细胞培养操作指南

在生物医学实验中，正确的耗材灭菌方法和细胞培养操作是确保实验成功的关键。本文将详细介绍微量离心管（EP管）和细胞培养瓶的高压蒸汽灭菌方法，以及细胞培养的基本知识和操作流程。

微量离心管和细胞培养瓶的高压蒸汽灭菌方法

微量离心管（EP管）的灭菌方法

微量离心管（EP管）可以进行高压灭菌。聚丙烯（PP）材料的离心管适合高压灭菌，但需要注意不要拧得太紧，否则在冷却过程中可能会发生变形。

细胞培养瓶的灭菌方法

细胞培养瓶的高压蒸汽灭菌步骤如下：

1. 将待灭菌的细胞培养瓶放置在高压灭菌锅中，注意瓶盖朝下放置，以防止水分进入瓶内。
2. 加入适量的蒸馏水，使高压灭菌锅内保持高湿度。

细胞培养的基本知识

操作前准备工作

1. 玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：高压蒸汽灭菌15分钟以上，或干烤消毒140度2小时以上。
2. 无菌工作台的准备：先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上；各种培养板照射3小时以上。
3. 培养基的准备：配制好的培养基（pH7.2）和血清需要进行无菌试验。将血清按10%加入培养基内，在无菌的玻璃离心管或玻璃瓶中取5-10ml培养基，置培养箱内培养2-3天，肉眼观察无浑浊或沉淀等异物。分装后置-20度保存。
4. 消化液的准备：消化液（pH7.8）或其他加入液需要高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存。
5. 液体复温：各种冻存的液体复温时应边摇边融化，避免产生沉淀。
6. 培养箱的清洁：先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍，如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌。至少每月一次。
7. 无菌操作注意事项：操作前清洗双手及手腕，用75%酒精擦拭。操作时注意无菌台内空间层次，手及物品不要在暴露的瓶口上方来往。培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离。开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，开开后应用灯先烧口，然后烧盖。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。

细胞复苏

1. 应遵守慢冻快融的原则。先将水温锅调至37-37.5度，取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。
2. 在无菌台内将培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。

细胞传代

1. 贴壁细胞：去除旧的培养基后，加入适量的消化液（根据配制强度经验），晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。
2. 悬浮细胞：一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入培养基继续培养。如要高浓度可先离心500rpm,5min后加入培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入培养基继续培养。

无菌操作规范

1. 将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟。
2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋。
3. 手部用5%的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75%的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。
4. 最好戴口罩。
5. 操作时尽量靠近火焰。
6. 装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰。
7. 标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去。
8. 中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75%的酒精棉球消毒。

一般来说，如果你培养的细胞是贴壁生长的话，去除旧的培养基后，不管是直接加入新鲜培养基吹打(细胞易脱落)，还是在胰酶消化后用新鲜培养基吹打，都可不用台盼兰染色，因为，死的细胞都掉落在旧培养基里，而活的细胞则贴在壁上。如果细胞是悬浮生长的，则需要用台盼兰染色。不要担心计数不准，因为你可以将染色液的体积换算回去呀。比如0.1ml细胞悬液加0.1ml台盼兰，在EP管内混匀后计数，计数完的细胞数×2不就还原了吗。你在计数板中看到的亮点就是细胞，当细胞单个悬浮时，光的通透性就强一些，而细胞成片贴壁时，细胞就暗一些，是正常的。