研究揭示梨驯化改良过程中DNA甲基化对果实成熟的作用机制

研究揭示梨驯化改良过程中DNA甲基化对果实成熟的作用机制

南京农业大学吴俊教授团队在《Genome Biology》期刊上发表了一项重要研究，揭示了梨驯化和改良过程中DNA甲基化的作用机制。研究发现，在梨的驯化和改良过程中，全基因组DNA甲基化水平显著增加，这种变化与编码DNA去甲基化酶的基因表达水平降低密切相关。研究还鉴定出梨的驯化和改良过程中的差异化甲基化区域（DMRs），并发现这些区域与果实成熟密切相关。

梨（Pyrus ssp.，蔷薇科杏仁核亚科）是世界上最重要的温带水果作物之一。与野生梨相比，栽培梨的果实在许多形态特征上表现出显著变化，包括果实大小、含糖量和核细胞含量。野生梨和栽培梨之间的比较分析可以深入了解关键表型变化的演变。DNA甲基化是一种重要的可遗传表观遗传学标记，可以改变基因组区域可及性，抑制或激活基因表达，最终导致表型变化。然而，表观等位基因在多年生果树驯化中的重要性尚待发现。

在植物中，胞嘧啶DNA甲基化发生在三种不同的背景中：CG、CHG和CHH（H=A、T或G）。DNA甲基化水平受到四种去甲基化酶的调节，包括抑制沉默1/Demeter样1（ROS1/DML1）、Demeter（DME）、Demeter样2（DML2）和Demeter样3（DML3）。

研究方法

研究人员对41份亚洲梨（Pyrus pyrifolia）样本（包括野生品种、地方品种和改良品种）进行了单碱基分辨率的甲基化分析。通过比较甲基化分析，在梨的驯化和改良过程中全基因组DNA甲基化水平增加，与编码DNA去甲基化酶的基因表达水平降低相关。研究还鉴定出梨的驯化和改良过程中的差异化甲基化区域（DMRs）。高甲基化DMRs基因与植物衰老和果实成熟显著相关。

研究结果

1. 人对Demeter样1（DML1）选择可能与梨驯化和改良过程中DNA甲基化增加有关

研究人员构建了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）文库，包含41个代表性P. pyrifolia品种的两个生物学重复，其中包括14个野生品种、12个地方品种和15个改良梨品种。平均BS转化率为99.44%。以P. pyrifolia “Cuiguan”基因组为参考基因组。

图1：梨基因组中DNA胞嘧啶甲基化水平的分布模式

• 17条梨染色体上的CG、CHG和CHH下DNA甲基化水平的密度分布、基因密度和TE密度。
• 三个梨品种（野生品种、地方品种和改良品种）中CG、CHG和CHH甲基化胞嘧啶（mC）平均比率。
• 野生品种、地方品种和改良品种中CG、CHG和CHH甲基化水平进行比较（*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001，双尾配对学生t检验）。
• 基因和转座元件（TEs）的上下游±2kb区域、和genebody区域的DNA甲基化水平分布。
• 在野生品种、地方品种和改良品种中，PpyDML1.1、PpyDML1.2和PpyDML1.3的相对基因表达水平比较（FPKM）。PpyDML1.1、PpyDML1.2和PpyDML1.3在梨驯化和改良过程中表达水平持续下降（*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001，使用cuffdiff进行差异表达分析）。

2. 梨驯化和改良过程中CG和CHG甲基化的共同进化

图2：野生品种梨 vs地方品种梨以及地方品种梨vs改良品种梨的差异甲基化区域（DMRs）比较

• CG中的DNA甲基化水平主成分分析（PCA）图。黄色方块：野生梨品种，蓝色点：地方品种，绿色三角形：改良品种。
• CHG中的DNA甲基化水平主成分分析（PCA）图。
• 比较野生与地方品种、地方品种与改良品种以及野生与改良品种的高甲基化/低甲基化DMRs（hyper/hypo-DMRs）数量。
• c中三种比较中高甲基化/低甲基化DMRs的总长度。
• 比较野生与地方品种和地方品种与改良品种比较中，DNA序列选择区域（DSRs）长度与CG和CHG背景DMRs的长度（*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001，双尾配对学生t检验）。
• 显示DSRs和DMRs的基因组组成，包括转座元件（TEs）、内含子、外显子和基因间区域。
• 对17条梨染色体上野生与地方品种群间DMRs分布图。从外圈到内圈的数据分别代表TE密度（I）、基因密度（II）、驯化过程中CG-DMR密度（III）、驯化过程中CHG-DMR密度（IV）、改良过程中CG-DMR密度（V）、改良过程中CHG-DMR密度（VI）、驯化过程中的DSR（VII）和改良过程中的DSR（VIII）。
• 对野生与地方品种（CG和CHG背景）以及地方种与改良品种之间的DMRs重叠分析。
• 对野生与地方品种（驯化过程）和地方品种与改良品种（改良过程）比较中两种甲基化背景的DMRs重叠。
• 在梨驯化过程中，o_CG_CHG_DMRs（CG-DMRs与CHG-DMRs重叠区域）的CG和CHG甲基化水平相关性分析。
• 在梨改良过程中，对o_CG_CHG_DMRs的CG和CHG甲基化水平进行相关性分析。

3. 遗传多样性变化与梨驯化和改良过程中的DNA甲基化变化无关

图3：梨的驯化过程中差异甲基化区域（DMRs）的遗传多样性变化：

• a-d. 所有梨（a）和野生品种梨（b）、地方品种梨（c）和改良品种梨（d）不同基因组组成中DMR、DSRs和NSRs之间的遗传多样性比较（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS，不显著；双尾配对学生t检验）。不同基因组组成包括基因间区域、TE、外显子和内含子。
• e-f. 在驯化（Dom-DMRs）（e）和改良（Imp-DMRs）（f）过程中，高甲基化DMRs和低甲基化DMRs的遗传多样性变化。每一条黑线代表一个DMR。
• g. dom CG DMR、dom CHG DMR、imp CG DMR和imp CHG DMRs中DNA甲基化水平与遗传多样性之间的关系。

4. DMRs遗传基础的meQTL分析

图4：梨驯化和改良过程中差异甲基化区域（DMRs）的遗传基础。

• 在梨驯化和改良过程中鉴定的meQTL的染色体位置分布。x轴表示显著SNPs的基因组位置，y轴表示SNPs相应DMR的基因组位置。点的颜色表示meQTL分析中的P值。meQTL显著阈值设定为1.78×10−9（0.01/N，N=5618948），仅绘制显著meQTL。Dom-CG-DMR代表野生和地方品种之间的CG DMR；Dom-CHG-DMR代表野生和地方品种之间的CHG DMRs；Imp-CG-DMR代表地方品种和改良品种之间的CG-DMR；Imp CHG DMR代表地方品种和改良梨品种之间的CHG DMRs。
• 每个DMR的显著SNP数量分布。
• 每个SNP的显著相关DMR的数量分布。
• 梨驯化和改良过程中CG和CHG DMRs的遗传基础。

5. DNA甲基化对基因表达的作用

图5：梨驯化改良过程中DNA甲基化与基因表达水平的相关性研究。

• 在2kb上游、基因体和2kb下游区域的所有基因的CG和CHG甲基化水平与表达水平之间的关系。根据表达水平将基因分为四组（低、中低、中高和高）。
• b-c. 梨驯化（b）和改良（c）过程中，2kb上游、基因体和2kb下游区域的基因表达水平与CG和CHG环境中DMR甲基化水平之间的Pearson相关系数分布。

6. 梨驯化和改良过程中DNA高甲基化与果实早熟有关

图6：梨CAMTA2基因中的一个高甲基化DMR以及它在梨驯化和改良过程中的作用。

• 梨驯化过程中高CG DMR相关基因的GO富集分析（前15个显著项）。
• 梨改良过程中高CG DMR相关基因的GO富集分析（前15个显著项）。蓝色星号表示与衰老相关的GO术语。
• CAMTA2基因结构如图顶部所示。外显子用黄色阴影框表示，内含子用黑线表示，蓝色阴影框表示5′和3′UTR。下图显示了野生、地方品种和改良梨品种中位于CAMTA2基因中的DMR（Chr13:26073542–26073668）的CG甲基化水平。上图表示整个基因（2kb上游、基因体和2kb下游区域），下图扩大显示第11外显子中的DMR。
• 野生品种（黄框）、地方品种（绿框）和改良品种（蓝框）梨中CAMTA2表达水平（FPKM）的比较（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS，不显著；双尾配对Student t检验）

图7：CAMTA2在转基因梨愈伤组织和转基因番茄植株中的作用。

• CAMTA2基因在对照和5′-氮杂胞苷（5′-Aza）处理的梨愈伤组织中的相对表达。
• CAMTA2-GFP融合蛋白定位于农业过滤的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片细胞的细胞核。
• WT和CAMTA2过表达（OE）梨愈伤组织的生长。P1=继代培养后立即，P2=继代培养后14天，P3=继代培养后24天。
• d-e. 用甲苯胺蓝染色的梨愈伤组织的横截面。图像显示了过表达CAMTA2（e）的WT（d）和转基因梨愈伤组织的横截面的相同视野中的细胞数量。比例尺=100μm。
• f. T1代转基因幼苗在移植前的生长状况。比例尺=1cm。
• g. WT和T1代CAMTA2-OE幼苗根长的统计分析。
• h. WT和CAMTA2-OE转基因番茄植株的表型。比例尺=1cm。
• 2. 野生型和转基因番茄植株株高的统计分析。
• j. WT CAMTA2-OE转基因番茄果实在盛开后43、46、49、52、55和57天（DAFB）的代表性表型。
• k.在红期收获的WT和CAMTA2-OE转基因番茄果实硬度统计分析。

研究结论

本研究结果表明，在梨的驯化和改良过程中DNA甲基化的整体增加。这种DNA甲基化增加与 DML1表达下调显著相关。在梨的驯化和改良过程中，分别鉴定出1242个和4349个DMR。高DMRs附近基因与植物衰老和果实成熟显著相关。研究还验证了高DMRs相关基因CAMTA2的功能，即CAMTA2过表达抑制果实成熟。简言之，本研究报告了在梨的驯化和改良过程中DNA甲基化的增加模式，并表明增加的DNA甲基化在调节梨果实成熟期中起着至关重要的作用。