EM-seq：酶法甲基化测序，甲基化测序的新选择

EM-seq：酶法甲基化测序，甲基化测序的新选择

DNA甲基化作为一种关键的表观遗传修饰，已被广泛认为在基因表达调控、细胞分化以及多种疾病的发生发展中扮演着重要角色。DNA甲基化：将甲基基团添加到DNA分子的胞嘧啶上，可以影响基因的活性而不改变DNA序列，这种改变的持久性和可逆性使得甲基化成为表观遗传学研究的热点。

研究者们开发出多种技术来检测DNA甲基化，以期更好地理解生物学功能和调控机制。WGBS长期以来被视为检测DNA甲基化的“金标准”，提供了高分辨率的甲基化图谱。但WGBS在用亚硫酸氢盐处理DNA时，会损伤和降解DNA，这样导致所需样本起始量高。随着新技术的涌现，特别是酶法甲基化测序（EM-seq）的引入，我们拥有了更多的选择来进行DNA甲基化的检测。本期，我们来介绍下DNA甲基化检测技术的新星——酶法甲基化测序（EM-seq）。

EM-seq技术介绍

2021年，发表在Genome Research上的一项研究提出一个基于酶反应的EM-seq技术[1]，该技术可以检测DNA上的5mC和5hmC修饰，且不引入通常与亚硫酸氢盐测序相关的偏差。该技术主要需要3种酶和2次反应。

• TET2：甲基胞嘧啶双加氧酶2（Tet methylcytosine dioxygenase 2）
• T4-BGT：T4噬菌体-糖基转移酶（T4-phage beta-glucosyltransferase)
• APOBEC3A：载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3A）

EM-seq原理和流程

TET2是一种依赖于铁（II）/α-酮戊二酸的双加氧酶，它催化5mC氧化为5hmC，然后是5-甲酰胞嘧啶（5fC），最后是5caC，同时形成二氧化碳和琥珀酸（图1A）。T4-BGT催化TET2形成和基因组的5hmC的糖基化为5-（β-糖基羟甲基）胞嘧啶（5gmc）（图1B）。接下来，APOBEC3A脱氨胞嘧啶，但不脱氨5mC或5hmC的保护形式，从而使它们能够进行区分（图1C）。

图1：参与5mC和5hmC检测的酶

工作流程：首先由TET2和来自T4噬菌体的葡糖基转移酶T4-BGT将甲基化的胞嘧啶处理为无法被APOBEC3A转化的形式，这和WGBS亚硫酸盐的逻辑相似，甲基化的C无法被转化，而正常无甲基化的C会在APOBEC3A的作用下转化成U，然后在经过测序进行后续的分析。EM-seq通过酶转化的方式能够显著降低DNA损伤，将DNA起始量降低至最低100 pg也可以得到非常稳定的检测结果。

图2：EM-seq的作用机制和工作流程[1]

技术优势

聊了很多EM-seq的原理和流程，我们来看看EM-seq的技术优势。研究分别使用10、50和200 ng的NA12878基因组DNA制备EM-seq和亚硫酸氢盐文库。

A. 样本起始量低，但文库质量更高

EM-seq文库对所有DNA输入的PCR周期具有更高的文库产量（图2A），产生更少的测序重复，导致更多可用reads，从而增加了有效的基因组覆盖率（图2B）。EM-seq库也比亚硫酸氢盐库产生了更规范化的GC偏倚谱，亚硫酸氢盐库具有“富AT”和“贫GC”谱（图2C）。

图2：用10 ng、50 ng或200 ng的NA12878DNA制备EM-seq和重亚硫酸盐文库[1]。

低输入量文库的表现与10ng至200ng DNA文库在GC偏差图上的表现相似，显示出均匀的覆盖率，在CpG、CHG和CHH环境中也有相似的全局胞嘧啶甲基化。

图3：低DNA输入EM-seq文库。

B. EM-seq可准确地表示甲基化

EM-seq和亚硫酸氢盐的NA12878文库在所有DNA输入中具有相似的胞嘧啶甲基化。研究还比较了EM-seq和亚硫酸氢盐文库之间的CpG检测，使用1×到21×的覆盖深度。同样覆盖深度（低深度），EM-seq检测到更多的CpG。

图4：EM-seq准确地表征甲基化

案例解析

案例一：SPOCD1是piRNA指导的从头DNA甲基化的重要执行者[2]

• 发表期刊：Nature
• 发表时间：2020
• 研究物种：小鼠精原细胞
• 主要内容：
  在哺乳动物中，从体细胞获取生殖系面临一个至关重要的挑战：需要擦除和重置基因组的甲基化。在雄性生殖系中，RNA导向的DNA甲基化使年轻、活跃的转座子沉默。PIWI蛋白MIWI2（PIWIL4）及其相关的PIWI相互作用RNA（piRNA）指导转座子的DNA甲基化。piRNA被认为可以将MIWI2固定在新生的转座子转录本上；然而，MIWI2如何指导转座子的从头甲基化机制仍不甚了解，尽管这对生殖系的永生至关重要。
  该研究定义了在小鼠胎儿生殖细胞中进行新基因组甲基化时MIWI2的相互作用组，识别出一个之前未知的MIWI2相关因子SPOCD1，它对年轻转座子的甲基化和沉默是必不可少的。在小鼠中，Spocd1的缺失导致雄性特异性不育，但不影响piRNA的生物合成或MIWI2在细胞核中的定位。SPOCD1是一种核蛋白，其表达仅限于基因组从头甲基化的时期。它在体内与DNMT3L和DNMT3A共同纯化，这些都是新甲基化机制的组成部分，同时也与NURD和BAF染色质重塑复合物的成分相互作用。研究提出了一个模型，MIWI2与新生转座子转录本的结合通过SPOCD1招募抑制性染色质重塑活动和从头甲基化的功能。总之，研究发现了一个之前未被认识到的、对哺乳动物piRNA导向的DNA甲基化至关重要的执行因子。

图：SPOCD1是转座因子位点的从头DNA甲基化所必需的，而不是piRNA的表达

循环游离DNA（cfDNA）是一种多样化的核酸片段，主要来源于肿瘤细胞、正常细胞以及胎盘细胞，通常以几十到几百个碱基对的形式存在于血液等体液中。cfDNA的浓度和特征能够随着个体的生理状态或疾病进展而变化，尤其在癌症患者中，它可以作为肿瘤特异性突变的生物标志物，助力非侵入性监测和早期诊断。同时，孕妇体内的cfDNA也为胎儿健康监测提供了新的可能性。与传统组织活检相比，cfDNA检测更安全、便捷，且在体外维持相对稳定，在临床检测上具有较为广泛的应用场景。

此外，cfDNA中的异常甲基化总是与肿瘤细胞中的异常甲基化同时出现，血浆cfDNA中基因异常甲基化具有较高的敏感性和特异性。因此，游离DNA甲基化成为了一种稳定可靠的癌症标志物。酶法转化的EM-seq显著优势在于低投入和低DNA损伤，因此，cfDNA甲基化研究和EM-seq是绝佳的搭档。

案例二：通过浆细胞游离DNA的靶向酶促甲基测序来检测肝细胞癌[3]

• 发表期刊：Clinical Epigenetics
• 发表时间：2023
• 研究物种：外周血cfDNA
• 主要内容：
  循环肿瘤DNA携带的表观遗传变异可作为非侵入性液体活检早期检测肝细胞癌（HCC）的生物标志物。然而，传统的甲基化分析方法，即双硫酸盐测序，由于DNA损伤严重的缺点，在少量cfDNA分析中的应用受到限制。
  通过温和的酶介导转化，酶甲基测序（EM-seq）非常适合精准测定游离DNA的甲基化水平，为肝细胞癌（HCC）的早期检测提供了机会。甲基化对照组DNA的EM-seq分析显示，将未甲基化的C转化为U的酶促转化效率高于亚硫酸氢盐转化。此外，相对较大比例的未完全转化的EM-seq reads中，包含超过3个未转化的CH位点（CH=CC、CT或CA），这些可以通过过滤去除，从而提高EM-seq甲基化检测的准确性。研究分析了241例HCC、76例肝病和279例正常血浆样本，使用EM-seq和靶向捕获技术测量1595个CpG位点的甲基化值。模型训练确定了283个CpG位点在HCC与非HCC样本之间存在显著的甲基化水平差异。基于这些标记的HCC筛查模型能够有效区分HCC样本和非HCC样本，在测试集中曲线下面积为0.957（sensitivity=90%，specifcity=97%），在不同阶段以及在血清α-胎蛋白/维生素K缺乏II诱导的蛋白阴性样本中表现良好。