病毒中和试验完整版本

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文档简介

病毒中和试验（Virus Neutralization Test）是一种用于检测患者血清中抗体消长情况、抗原免疫原性评价，以及鉴定未知病毒或对病毒进行半定量等的实验方法。本文详细介绍了病毒中和试验的背景、原理、方法、应用、各种方法的利弊分析、发展趋势以及质量控制等内容。

一、背景介绍

1. 当病原微生物侵入机体时会诱导机体体液免疫产生相应的抗体。
2. 病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
3. 病毒完整的复制周期
4. 病毒的中和抗体（neutralization antibody）指：针对病毒某些表面抗原的抗体，此类抗体能与细胞外游离的病毒结合从而消除病毒的感染能力。
5. 中和抗体的作用机制：

• 直接封闭病毒表面抗原，如与病毒表面吸附蛋白（VAP）结合，从而阻断病毒的吸附
• 改变病毒表面结构
• 病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除
• 有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的裂解

图1. 中和抗体作用机制

Antibodies can neutralize viral infectivity in a number of ways, as summarized in the illustration. They may interfere with virion binding to receptors, block uptake into cells, prevent uncoating of the genomes in endosomes, or cause aggregation of virus particles. Many enveloped viruses are lysed when antiviral antibodies and serum complement disrupt membranes.

6. 病毒中和试验：Neutralization of a virus is defined as the loss of infectivity through reaction of the virus with specific antibody.以测定病毒感染力为基础，以病毒受免疫血清中和后残存的感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。常用于检测患者血清中抗体消长情况，抗原免疫原性评价，也可用来鉴定未知病毒或对病毒进行半定量等。

二、原理

特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种病毒只能被相应的免疫血清所中和。中和一定量的病毒的感染力必须有一定效价的中和抗体。

三、方法

1. 中和实验验可分为体内试验和体外试验

• 体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。

疫苗或抗血清一定时间适量病毒致死状态等判断结果

• 体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。

2. 根据稀释成分不同可分为两种方法。

• 一为固定病毒用量与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验，以血清中和抗体滴度表示。
• 二为固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。结果以中和指数表示。

固定血清稀释病毒法：已知效价的抗血清（通常为阴性对照）测定未知效价的抗血清结果以中和指数表示

试验组LD50(EID50、TCID50)
中和指数=──────────────────
对照组LD50(EID50、TCID50)

固定病毒稀释血清法：已知效价的病毒测定抗血清的效价结果以血清中中和抗体滴度表示

四、应用

1. 蚀斑减少中和实验（Plaque Reduction Neutralization Test PRNT）

蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。

以HCMV中和抗体效价测定为例

• 2倍稀释血清样品，终体积0.2ml
• 200PFU HCMV每孔0.2ml加到24孔板中
• 以长成单层MRC-5细胞
• 37℃孵育1h
• 弃去液体，PBS洗三次
• 含0.3%琼脂的维持液覆盖
• 3-5天再次覆盖
• 14天甲醛固定
• 孵育1h
• 甲基蓝染色

中和抗体效价的测定

同时设病毒对照和细胞对照，病毒对照组只加病毒不加血清，细胞对照组用维持液代替血清和病毒。

病毒对照组细胞全部病变（100%），细胞对照组不出现噬斑。

图2. 登革热病毒感染敏感细胞出现的蚀斑

2. 快速微量中和试验

一种人巨细胞病毒中和抗体效价快速检测方法的建立

HCMV感染具有严格种属特异性，一般体外采用HELF（人胚肺成纤维细胞）增殖该病毒，体外的感染实验也多在一些成纤维细胞如MRC-5上进行。但是HCMV完整的增殖周期比较长，一般一周左右才能裂解细胞释放病毒粒子。IE1是病毒进入细胞后最早表达（2-4h)的蛋白之一，6小时便可在细胞核中检测到。IE基因对病毒的E基因以及L基因的表达乃至整个病毒的复制周期都有非常重要的作用。

实验流程

• 血清灭活
• 用维持液2倍稀释血清
• 每孔终体积25μl
• 与等体积已知滴度的病毒混合，37℃中和
• 不同时间56℃30分钟，不同来源的血清灭火温度和时间可能不同
• 45min
• 60min
• 75min
• 90min
• 步骤一
• 步骤二
• 动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。
• 加至已长成单层的MRC-5细胞
• 步骤三
• 所铺细胞数目要求较高，防止细胞叠层
• 16h，18h，20h梯度
• 乙醇固定细胞，封闭30min
• 相继用IE1单抗，生物素标记羊抗鼠IgG，链霉亲和素-HRP，以及底物显色
• 图像采集与数据处理

实验组
病毒对照
细胞对照

步骤一
25μl血清
25μl维持液
25μl维持液

步骤二
25μl病毒
25μl病毒
25μl维持液

步骤三
50μl混合液
50μl混合液
50μl混合液

图3. 感染HCMV的MRC-5细胞的体视显微镜（B，×25）图像

本实验的优点体现在以下几个方面

• HCMV感染普遍存在，不管是患者血清学检查或是开发HCMV特异中和抗体产品（如杂交瘤细胞产中和抗体的检测或是成品的质控），快速准确的测定样品中中和抗体效价都是关键。以往运用普通的中和试验，观察典型CPE出现，需要6-7天才能得出结果，离实际需要相差很远。本实验采用96孔板里做酶联免疫检测病毒IE1基因的表达，来确定病毒是否被中和抗体所中和，检测结果可在两天内读出。
• 抗HCMV IE单抗的出现促进酶联免疫法在HCMV中和抗体效价检测中的应用，一些新型快速微量中和试验相继建立，但结果需通过人工计数，检测通量不高，本实验使用CCD进行图像采集和克隆计数软件分析和计算，结果准确客观
• 本实验参照酶联免疫斑点法（ELISPOT），并使用生物素-亲和素系统对信号进行放大，灵敏度有所提高。反应在96孔板中进行，样品用量仅为25μl，节约成本。无需昂贵的荧光显微镜，不受荧光信号容易淬灭影响。

五、各种方法利弊分析

体内试验能够更加真实的反映病毒和抗血清在体内的作用状态。然而试验成本较高，而且实验受动物个体间免疫力差异影响较大，实验结果不稳定，重复性也不如体外实验。中和试验滴定终点的判断通常以半数致死剂量LD50（体内实验）或是半数致细胞病变剂量CCID50为指标。然而很多病毒感染敏感细胞并不出现典型的CPE或是CPE出现比较晚，无法满足临床上需快速及时监测患者血清学状态的要求。通常滴定终点的判断还需要有经验，不同操作者之间主观因素影响较大。CPE只能在细胞水平反映病毒的感染状态，对于病毒是否进入细胞（中和抗体主要作用是在病毒吸附和侵入阶段阻断病毒感染），感染进程无法体现。

六、发展趋势

中和试验自出现以来，一直在朝着快速，准确，微量，重复性好等目标发展。先后出现了，噬斑减少中和试验（PRNT）,快速微量中和试验等。随着各种病毒感染细胞周期事件的阐明，各种针对病毒蛋白的单克隆抗体研制工艺的成熟。利用酶联免疫检测病毒是否进入细胞，比以往的出现CPE才认为是病毒进入细胞更准确，更快速。而且能从分子水平反映细胞的实际感染状态。

七、质量控制

因目前尚无CMV中和抗体的国家标准品，该方法的准确性无法验证，下面分别对精密性，耐用性和专属性进行验证。

• 精密性验证
• 重复性验证对同一份CMV-IVIG样品在同一次试验中平行检测12次，计算变异系数（CV）
• CV=σ/μ
• σ为方差，μ为平均值
• 中间精密性验证
• A：不同操作者对同一份样品分别检测三次
• B：同一操作者不同工作日对同一份样品检测三次
• 分别计算CV
• 稳定性验证
• 同一份CMV-IVIG样品系列稀释后与等体积病毒液于37℃分别孵育55,60，65min检测HCMV中和抗体效价
• 特异性验证
• 水痘带状疱疹病毒(vzv)感染MRC-5细胞，37℃培养18h，固定后进行免疫染色观察感染细胞核内是否出现特异性着色颗粒。另取4份血浆样品，2份普通IVIG样品，4份CMV-IVIG样品分别与MRC-5细胞37℃共同孵育18h，固定后进行免疫染色，观察核内是否出现特异性着色颗粒，阴性对照加等量培养基，阳性对照加等量病毒液。

补充病毒感染细胞的判断

判断细胞被病毒感染的方法最直接的就是CPE（cytopathic effect），此外还有细胞内病毒蛋白的免疫印迹；非特异的化学方法如病毒感染导致细胞死亡MTT法。

参考文献

[1] A rapid microneutralization assay for cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 14(1986) 37-41
[2] A rapid microneutralization assay for the measurement of neutralizing antibody reactive with human cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 23(1989) 157-168
[3] Effect of Previous or Simultaneous Immunization with Canarypox Expressing Cytomegalovirus (CMV) Glycoprotein B (gB) on Response to Subunit gB Vaccine