凝胶过滤层析技术详解

凝胶过滤层析技术详解

凝胶过滤层析是一种根据分子大小和形状差异进行分离的简单可靠的层析技术。当生物分子通过凝胶过滤填料时，分子量大的生物分子只能通过大的孔径，而小分子量的生物分子会经过小的孔径，因此与大分子量的生物分子相比，小分子量的生物分子经过的路程会更长。凝胶过滤层析的全过程只用一种缓冲液即可将不同分子量的生物分子进行分离。

特点

• 填料主要为惰性（无反应性或吸附性）的球状疏松多孔颗粒，具有均匀的分离范围
• 目标分子不与介质结合，通常仅需一种缓冲液
• 缓冲液成分不直接影响分辨率（即峰之间的分离程度），可以根据样品的稳定性选择相应的缓冲液，非常适合对 pH 变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子
• 对装柱效果要求较高，一般推荐使用预装柱
• 上样体积一般为特定比例的柱体积，上样体积相对受限

基本步骤

凝胶过滤层析为非吸附性层析，实验步骤主要包括平衡、上样、洗脱三步（图8）。

1. 平衡：使用相应的缓冲液冲洗层析柱，使层析柱平衡至所需的实验条件中。
2. 上样：将合适体积的样品通过样品环等容器加入层析柱中。
3. 洗脱：使用平衡缓冲液冲洗层析柱，使加入层析柱的样品逐渐被分开并洗脱到不同的组分中。

图8 凝胶过滤层析流程

（A）电子显微镜下的填料颗粒放大图。（B）样品中不同分子进入填料不同孔的示意图。（C) 分离过程的描述 (i）上样到层析柱；（ii）最小的分子（黄色）比最大的分子（深橘色）相比在层析柱上延迟更多；（iii）最大的分子最早被从层析柱上洗脱。样品在层析过程中被明显的稀释。（D）层析图谱示意图。

适用性

• 组群分离：可以从一组较大的分子中去除小分子，或者快速、简单地进行缓冲液置换，上样体积一般小于30%CV（Column Volume，柱体积）。
• 精细分离：去除其他层析方法没有去除的杂质，多聚体等，上样体积一般为5%～5%CV。
• 定性分析：蛋白均一性分析、分子量大小及分布的测定等。

填料选择

常见的凝胶过滤层析填料主要有Superdex系列、Superose系列、Sepharose系列、Sepharose CL系列、Sephacryl S系列和Sephadex系列，每个系列填料的特性及适用范围见表7。

凝胶过滤填料选择应遵循以下原则：

1. 明确实验目的，如果要进行脱盐或缓冲液置换，可以选择Sephadex系列填料，如果要进行精细分离纯化，首选Supedex或Superose等高分辨系列的凝胶过滤填料。
2. 选择合适的分离范围，要确保待分离的蛋白在所选的填料的分离范围之内。
3. 根据样品体积选择合适的层析柱体积，在进行精细分离时凝胶过滤上样量不超过5%柱体积，一般建议为2%～3%柱体积，因此如24 mL层析柱一般建议上样体积为不超过500 μL。120 mL层析柱建议上样体积为不超过5 mL。在进行组份分离如脱盐时，最大上样量不超过30%柱体积，如5 mL 脱盐柱最大上样体积一般不超过1.5 mL。
4. 在预装填的层析柱和散装填料间，建议使用预装填的层析柱以保证更高的柱效。