【前沿进展】Brain | DBS缓解癫痫，闭环刺激和开环刺激谁更有效？
【前沿进展】Brain | DBS缓解癫痫，闭环刺激和开环刺激谁更有效？
间质性颞叶癫痫（MTLE）是成人最常见的局灶性癫痫，约30%的患者对药物治疗耐药，并伴有认知功能障碍，如记忆缺陷。MTLE的主要病理学特征是海马硬化（HS），表现为神经元丢失和反应性胶质增生，常伴有颗粒细胞离散和苔藓纤维发芽。对于有多个发作焦点或存在手术风险的患者，手术切除已成为唯一的根治性治疗方法，但仍有很大局限性，迫切需要新的治疗方法。
深部脑刺激（DBS）是一种替代性治疗选择，可以通过高频刺激（HFS）来中断发作传播，但HFS在海马硬化组织中效果有限。相比之下，低频刺激（LFS）在少数MTLE患者中显示可以减少发作，可能是由于LFS不太容易引发广泛性发作。海马-枕叶回路是学习、空间导航和记忆的中枢，DBS可能会影响这些认知功能，但LFS的认知影响尚不清楚。
本研究在MTLE小鼠模型中探索了一种闭环LFS（按需施加刺激）方案，可以在发作前启动10分钟的刺激来稳定海马网络，并评估其对认知功能的影响。结果显示，与开环LFS（持续施加刺激或间隔施加刺激）相比，闭环LFS同样能有效抑制发作，但刺激负荷显著降低。此外，LFS不会对海马功能产生不利影响，反而可以改善慢性癫痫小鼠的长期记忆障碍。总之，这项研究提供了一种新的治疗方法，可能克服现有DBS疗法的局限性，值得进一步探索。
闭环的低频电刺激(on-demand LFS)可以有效预防癫痫小鼠的局灶性发作簇
在这项研究中，研究人员采用实时检测癫痫样放电活动，并随后启动1Hz低频电刺激（LFS）的方法，成功抑制了慢性癫痫小鼠海马区域的自发性局灶性癫痫发作簇。
具体而言，癫痫小鼠海马区域存在三种不同类型的癫痫样放电簇：高负荷（HL）、中负荷（ML）和低负荷（LL），其中HL放电簇代表局灶性癫痫发作。为此，研究者设定了一个阈值（10秒内发放13次），一旦检测到超过该阈值的放电活动，就立即启动1Hz的LFS刺激。为了降低LFS诱发全身性癫痫发作的风险，研究采用了逐步增加刺激电流强度的方法，从而有效减少了LFS引发癫痫发作的概率。
结果显示，与参考组相比，采用实时检测和LFS干预的方法显著减少了HL放电簇的发生时间占比，而对ML和LL放电簇的发生时间占比则未产生明显影响。
图1. 闭环海马低频电刺激(LFS)对预防癫痫样高负荷放电簇的效果
图1A展示了研究中实时检测与低频电刺激（LFS）的实验设计。具体而言，当检测到10秒内出现13次局灶性放电峰值时，系统会立即启动为期10分钟的1Hz LFS刺激。这种闭环触发的LFS干预旨在抑制即将发生的癫痫发作簇。
图1B展示了参考组中记录到的局灶性放电活动，包括低负荷（LL）、中负荷（ML）和高负荷（HL）三种不同类型的放电簇，其中HL放电簇代表癫痫发作。
图1C展示了实时检测和LFS干预后的记录结果。当检测到ML放电簇时，系统立即启动了1Hz LFS刺激（粉色箭头和条）。结果显示，LFS刺激引发了神经元的群体性反应。
图1D比较了参考组和LFS干预组的HL放电簇占比。结果显示，LFS干预显著降低了HL放电簇的发生时间占比。
图1E比较了参考组和LFS干预组的LL、ML和HL放电簇的发生率。结果显示，LFS干预显著降低了HL放电簇的发生率，而对LL和ML放电簇的发生率则无明显影响。
与间歇性LFS和持续性LFS相比，闭环LFS具有更好的抑制局灶性发作簇的效果
与开环（间歇性）LFS（10分钟开/10分钟关）相比，闭环（按需施加）LFS在抑制高负荷（HL）放电簇方面效果更佳。闭环LFS将HL放电簇的时间占比从参考组的0.16±0.03降至0.02±0.01，而开环（间歇性）仅将其降至0.08±0.03。尽管连续开环（持续性）LFS完全消除了HL放电簇，效果最佳，但闭环LFS也显著降低了88%的HL放电簇时间占比，同时只需54%的刺激时间。
开环（持续性）LFS在抑制HL放电簇方面表现出最佳效果，将其时间占比从参考组的0.17±0.03降至0.00±0.00。与开环（间歇性）LFS和闭环LFS相比，开环（持续性）LFS在抑制癫痫发作方面更加可靠且可重复。
尽管开环（持续性）LFS的效果最佳，闭环LFS同样表现出优异的效果，减少了88%的HL放电簇时间占比，并且只需使用54%的刺激时间。这表明闭环LFS是一种有效的刺激方案，能够在减少刺激负荷的同时有效抑制癫痫发作。
这种闭环LFS方法基于一个假设，即从间歇性状态到发作性状态的转变是一个缓慢的动态过程，特征是神经网络抗性的逐步降低。因此，在发作前的过渡期触发LFS可以稳定海马网络，从而预防发作的发生。与以往针对发作起始点的研究不同，这种方法能够更及时地进行干预。尽管海马硬化区域存在广泛的神经元丢失、重塑和反应性胶质化，但它仍然是一个适合的刺激靶点。
图2. 与开环（间歇性）LFS（10分钟开/10分钟关）和开环（持续性）LFS相比，闭环LFS在抑制癫痫样放电方面更为有效。
图2A展示了实验时间线。同一批小鼠分别接受了开环（间歇性）LFS（第26-29天）、闭环LFS（第30天）和开环（持续性）LFS（第40-44天）的对比实验。
图2B和图2C展示了开环（间歇性）和开环（持续性）LFS时的代表性海马局部场电位（LFP）记录，显示了刺激引发的电位反应。
图2D显示，与参考组相比，开环（间歇性）LFS显著降低了高负荷（HL）放电的比例。
图2E和图2F显示，与参考组相比，闭环LFS和开环（持续性）LFS更有效地抑制了HL放电，开环（持续性）LFS甚至完全消除了HL放电。
图2G-2I显示，三种LFS方式在刺激开始后立即发挥抑制作用，并在整个实验期间保持稳定。
图2J展示了闭环LFS过程中刺激块与间歇时间的分布情况。结果表明，10分钟的刺激时间通常不足以完全消除癫痫样放电，因此需要多次触发LFS，总刺激时间达到20分钟。
图2K显示，闭环LFS与开环（间歇性）LFS在总刺激时间上相当（54% vs. 50%），但闭环LFS的抑制HL放电效果更佳（88% vs. 61%）。开环（持续性）LFS的抑制效果最为显著（99%）。
海马低频刺激可以改善癫痫小鼠的运动、焦虑和空间记忆障碍，但对非空间记忆无明显影响
慢性癫痫小鼠表现出焦虑样行为增加和空间导航策略改变等认知缺陷。有趣的是，海马低频刺激（LFS）不仅未加重这些缺陷，反而对长期记忆回忆产生了积极影响。LFS可能通过稳定海马网络状态，抑制癫痫发作，从而改善长期记忆的回忆。然而，LFS在健康对照组中导致了非空间性短期记忆的显著恶化，这表明LFS可能干扰健康海马的记忆功能。总的来说，这些发现为进一步探索LFS作为治疗局灶性癫痫综合征的替代疗法提供了新的思路，同时也强调了需要进一步研究LFS对认知功能的影响。
图3. 低频刺激能够有效抑制癫痫样放电，但并未改善小鼠的焦虑水平。
图3A和图3B显示，在海马内侧区域（HCi），KA组小鼠出现了神经元丢失和颗粒细胞离散（GCD）的病理变化，而对侧海马（HCc）则保持正常。
图3C和图3D显示，KA组小鼠在海马区域存在明显的星形胶质细胞反应（astrogliosis）。
图3E对颗粒细胞层（GCL）宽度进行了定量分析，结果表明，KA组小鼠的HCi区域GCL宽度明显增厚，而HCc区域则保持正常。
图3F对CA1区域的星形胶质细胞反应进行了定量分析，结果显示，KA组小鼠在HCi和HCc区域均存在明显的星形胶质细胞反应，其中HCi区域更为严重。
图3G显示，在旷场实验中，KA组小鼠的运动速度和在中心区域停留的时间均显著减少，表现出明显的焦虑样行为。
图4. 海马区域的LFS刺激可以有效缓解慢性癫痫小鼠的空间学习和长期记忆障碍，同时不会对正常小鼠的认知功能产生负面影响。
图4A展示了Barnes迷宫实验的设计。实验分为训练阶段（5天，每天3次）和测试阶段（24小时后）。在训练阶段，研究者测量了小鼠到达目标逃生洞的时间（主要逃生潜伏期）和在找到目标前访问的错误洞数（主要错误数）。在测试阶段，还评估了小鼠在迷宫四个象限（目标、左侧、右侧、对面）中的停留时间。
图4C和图4D显示，在训练过程中，所有四个实验组（正常对照组Sal-和Sal+，慢性癫痫组KA-和KA+）的小鼠都学会了找到目标洞，随着训练天数的增加，到达目标的时间显著缩短。然而，与正常对照组相比，慢性癫痫组的小鼠在学习过程中错误数没有明显减少，表明其学习行为发生了改变。
在第5天的训练中，接受LFS刺激的正常对照组（Sal+）比其他三组（KA-、KA+和Sal-）更快地找到目标，且错误数更少。然而，LFS刺激对癫痫组（KA+）和正常对照组（Sal+）的学习行为均未产生显著影响。
图4E-图4K显示，在测试阶段（24小时后），癫痫小鼠到达目标的时间显著延长，错误次数明显增加，表明其长期记忆能力受损。然而，给予癫痫小鼠低频电刺激后，其长期记忆表现与正常对照组无显著差异。
在无逃生洞的情况下，正常对照组小鼠在目标象限的停留时间显著长于相邻和对面区域，而癫痫小鼠在目标区和相邻区域的停留时间无差异，表明其对目标位置的记忆较弱。
在训练过程中，只有接受电刺激的正常对照组小鼠显著增加了直接搜索策略的使用，而癫痫小鼠则更倾向于采用串行搜索策略。
在最终测试中，癫痫小鼠主要采用串行搜索策略来定位目标，而正常对照组则更倾向于直接搜索。
图5. 在癫痫模型中，低频刺激虽能有效控制癫痫发作，但对海马依赖的认知功能并未带来明显改善。
图5A-图5B：短期空间记忆测试（对象位置记忆测试）结果：慢性癫痫小鼠在训练阶段的探索时间较正常对照组更长，但两组均未表现出对象位置偏好。在测试阶段，只有正常对照组能够显著区分新的对象位置，而癫痫小鼠组和接受低频刺激的组别均未能区分。低频刺激对短期空间记忆的影响并不显著。
图5F-图5J：短期非空间记忆测试（新颖物体识别测试）结果：在训练阶段，癫痫小鼠组的探索时间较正常对照组更长，但两组均未表现出对象偏好。在测试阶段，只有正常对照组能够显著区分新颖物体，而癫痫小鼠组和接受低频刺激的组别均未能区分。值得注意的是，低频刺激对正常对照组的短期非空间记忆产生了显著的负面影响。
图6. 低频刺激对癫痫小鼠的海马组织病理和病理生理特征有所改善，但对其在旷场实验中的行为表现未产生显著影响。
图6A-H：海马组织病理学评估癫痫小鼠在内侧海马区（HCi）出现了神经元丢失和颗粒细胞离散（GCD）的病理改变，而对侧海马区（HCc）则保持正常。HCi和HCc的颗粒细胞层（GCL）宽度存在显著差异，HCi的GCL宽度明显增厚。此外，癫痫小鼠CA1区的星形胶质细胞反应（GFAP）在HCi和HCc均有所增强，但在接受低频刺激（KA+）的组别中，CA1区的GFAP表达略有下降。
图6I：癫痫小鼠的病理生理学特征在行为测试开始前（第21-22天）和结束后（第36-37天），癫痫小鼠的HCi和HCc均出现了高负荷（HL）癫痫样放电，但在接受低频刺激（KA+）的组别中，HL放电的比例略有下降。
图6J-K：旷场行为评估癫痫小鼠（KA-组和KA+组）在旷场实验中的运动速度和在中心区停留的时间与正常对照组相比均无显著差异。
总结
这项研究探讨了在一种间歇性癫痫小鼠模型中使用闭环LFS来控制癫痫发作的效果。首先，研究通过免疫组化分析确认了小鼠海马硬化的病理特征。接着，设计了一种能够实时检测癫痫前兆活动的算法，在检测到此类活动时触发10分钟的LFS。研究结果显示，闭环LFS与开环（持续性）LFS在抑制癫痫发作方面同样有效，但刺激负荷显著降低。此外，行为学实验表明，闭环LFS不会损害海马功能，反而有助于改善慢性癫痫小鼠的长期记忆缺陷。总之，这项研究提出了闭环LFS作为治疗局灶性癫痫的一种有前景的替代疗法，能够在有效控制发作的同时，避免持续刺激对大脑功能的负面影响。