单纯疱疹病毒在神经科学研究中的应用

单纯疱疹病毒在神经科学研究中的应用

单纯疱疹病毒（HSV）是一种广泛存在于自然界中的病毒，具有独特的生物学特性。经过科学家的改造，HSV病毒在神经科学研究中展现出巨大的应用潜力，特别是在神经元示踪和基因治疗领域。本文将详细介绍HSV病毒的生物学特性及其在神经科学研究中的具体应用。

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)

简介：

单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus, HSV）属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，有HSV-1和HSV-2两种亚型。HSV基因组为约152 kb的线性双链DNA，由共价连接的长片段（UL）和短片段（US）组成，每一片段均含单一序列和反转重复序列，病毒感染宿主细胞后基因组会环化。HSV基因组中近一半为非必需基因，遗传改造空间大，可将大片段外源基因或多个转基因同时引入病毒基因组。（图1）

图1 HSV病毒粒子电镜图和基因组构成

H129是一个HSV-1型病毒的临床分离株，具有特异顺向跨突触的特性。经过多年在各种动物模型的活体测试中，发现其不仅能够标记中枢不同脑区之间的连接，也能标记外周与中枢不同脑区的连接。经过改造的病毒，装入荧光蛋白后可以实现高效、稳定的顺行跨突触标记神经元网络的功能，适合于神经输出环路的顺行示踪研究。HSV感染宿主范围广，在解析大/小鼠及非人灵长类及其他各种哺乳动物和禽类实验动物的神经信息向下游输出环路的研究中极具价值。

依据实验目的的不同可以分为3类：HSV扩增子、HSV顺向跨多级突触以及HSV顺向跨单级突触系统。

HSV扩增子

HSV-1扩增子载体为不含病毒结构蛋白，仅含有HSV-1的复制起始点ori和切割包装信号pac以及外源基因表达盒的假病毒载体。具有以下特点：

• 载容量大，其包装能力可达150Kb；
• 宿主细胞广泛，既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞，包括中枢神经系统；
• 不含编码病毒结构蛋白的基因；
• 不整合至宿主细胞；
• 不含有HSV-1的致病基因，仅含有HSV-1基因组的复制起始点ori和切割包装信号pac，具有很好的安全性；
• 含有HSV-1外壳，具有天然的HSV-1嗜性等优势。

这些优势使得HSV-1扩增子载体成为一种十分有力的神经系统疾病基因治疗载体，为中枢神经系统等多种系统疾病的基因治疗开辟道路。

HSV顺向跨多级突触系统

HSV-1型 H129株具有特异顺向跨突触的特性。病毒感染神经细胞后，在胞内复制并表达目的基因，子代病毒经轴突运输到突触前，跨突触进入下游神经元，开始新一轮的复制及跨突触传播等过程。将荧光基因插入其基因组中后能达到顺向跨多级突触标记神经元的效果。

HSV顺向跨单级突触系统

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV-TK）在HSV感染神经细胞后的急性神经节复制和复发性潜伏性神经节感染中起到重要作用（Coen et al., PNAS, 1989）。当HSV-TK缺失后，HSV-ΔTK能感染感染神经元，但是不能复制，进而失去了跨突触的能力。在表达TK 的辅助病毒的存在下，HSV-ΔTK-hUbC-tdTomato可以从起始神经元传播至突触后的神经元，从而标记出一个给定脑区或特定类型神经元的直接下一级受支配神经元。顺行一级跨突触标记系统极大地促进直接输出性神经网络的研究。

图2. 神经元顺向跨单级标记示意图

应用：

• HSV扩增子 :利用HSV扩增子病毒载体可实现大片段载体基因（＞5Kb）的过表达。
• HSV顺跨单级/多级突触（见案例展示） :

1. 研究大脑特定区域的全脑范围多级输出网络结构。顺行追踪感知觉系统信息从外周向中枢输入网络，从低级脑区向高级脑区的信息输出的网络结构；从高级脑区向低级脑区反馈信息输出的网络结构；
2. 神经发育过程中的神经网络变化；
3. 神经精神疾病模型中，大脑中枢及外周信息输出神经网络结构特征和异常变化；
4. 神经损伤及康复模型中，大脑中枢及外周信息输出神经网络的连接状况的损伤程度和恢复程度；
5. 追踪外周器官与中枢神经系统间的联系通路（可能会有一定程度的潜伏）。

案例展示

实例一：示踪nRT-PV 神经元下一级直接支配的神经元

• 实验动物：PV-cre 系小鼠
• 使用的病毒：H129-ΔTK-tdT 和辅助病毒AAV-DIO-TK-GFP
• 实验方法和结果：在PV-cre小鼠nRT脑区先注射cre依赖的TK辅助病毒，3周后注射H129-ΔTK-tdT，然后一些小鼠在第25 天灌流取材，确定跨突触的起始细胞；剩下的小鼠在第32 天取材，可以在多个脑区检测到信号，这些脑区包括VP，Po，VM等。

图3. 示踪nRT-PV 神经元下游直接支配的细胞（来源于武汉病毒所江海飞博士论文）

实例二：Htr2c神经元直接支配EW神经元

• 实验动物：Htr2c-Cre 系小鼠
• 使用的病毒：H129-ΔTK-tdT 和辅助病毒AAV-DIO-TK-GFP
• 实验方法和结果：在Htr2c-Cre小鼠vCA1脑区注射顺向跨单病毒，标记vCA1脑区Htr2c特异性神经元，一段时间后取材，可检测到EW脑区神经元被标记上了红色信号。表示EW区受上游vCA1脑区Htr2c神经元的直接支配。

图4. vCA1脑区Htr2c神经元直接支配EW区神经元（Xinyan,et al, Nature Neuroscience,2018）