Nature 揭示交替HFD通过中性粒细胞重编程加剧了动脉粥样硬化
Nature 揭示交替HFD通过中性粒细胞重编程加剧了动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是一种大中型动脉的慢性炎症性疾病，大多数关于动脉粥样硬化的病理生理机制的研究依赖于动物模型，通常使用持续高脂饮食（HFD）诱导的慢性高胆固醇血症。然而，这种模型在人类中并不适用，因为人类在生活中由于季节、移民或社会行为等因素，饮食习惯常发生变化，这导致了血浆胆固醇水平的波动，与实验模拟的持续HFD不同。关于交替HFD及其重新暴露在高胆固醇血症对动脉粥样硬化的影响仍知之甚少。
法国巴黎城市大学的 Hafid Ait-Oufella研究团队在Nature上发表题为“Alternating high-fat diet enhances atherosclerosis by neutrophil reprogramming”的研究文章。揭示了更符合人类日常饮食状态的交替高脂饮食促进动脉粥样硬化疾病发展的分子机制，强调了阻断IL-1β在治疗动脉粥样硬化中的潜在作用。这一发现为开发新的治疗动脉粥样硬化方案提供了非常有前景的靶点和策略，尤其是在调节炎症反应和免疫细胞功能方面，可能通过针对特定信号通路或分子机制来减缓或逆转动脉粥样硬化的发展。
研究亮点
- 交替HFD显著加剧了动脉粥样硬化的发展，并促使斑块形成更具侵袭性、更不稳定，从而增加破裂风险；
- 发现肠道微生物的变化并不是交替HFD加剧动脉粥样硬化的主要原因，并进一步排除了适应性免疫反应的影响。此外，通过RNA-seq分析发现，交替HFD显著改变了主动脉的转录组表达特征，尤其是髓样细胞稳态通路的富集。单细胞RNA-seq显示，中性粒细胞出现了两个亚群，其中一个亚群具有高度促炎特征，并在交替HFD组中显著增加；
- 用鼠源Ly6G单克隆抗体耗竭中性粒细胞后，交替HFD小鼠的动脉粥样硬化得到了明显抑制；
- HFD重新暴露引发了快速髓系前体成熟和应激性髓系生成，这一过程由TLR4信号通路驱动；
- 阻断IL-1β炎症通路显著消除了交替HFD引起的促炎反应和动脉粥样硬化的加速效应。
关键研究结果
结果1. 交替高脂饮食和动脉粥样硬化
为了研究高胆固醇再暴露对动脉粥样硬化的影响，制定了两种不同饮食方案（交替高脂饮食和连续高脂饮食）（图1a）。交替饮食导致血浆胆固醇水平随时间变化（图1b）。值得注意的是，交替高脂饮食导致动脉粥样硬化加速，主动脉及胸主动脉中的斑块增大（图1d-e）。交替高脂饮食还加重了雄性 Ldlr-/- 小鼠及雄性 Apoe-/- 小鼠中的动脉粥样硬化发展（图1f-g）。交替高脂饮食诱导了向更高级斑块表型的转变（图1h-i）。
图1 交替高脂饮食加速动脉粥样硬化
结果2. 交替高脂饮食与肠道微生物群、免疫反应
为了揭示交替高脂饮食加速动脉粥样硬化的机制，研究了肠道微生物群的作用。对6-10周龄的Ldlr-/-小鼠中进行16S rRNA测序，β多样性分析显示两组之间存在显著差异（图2a）。与喂食普通饮食相比，短暂高脂饮食小鼠显示出病原菌幽门螺杆菌属（Helicobacter）增加，同时Akkermansia属减少（图2b）。为了评估高脂饮食诱导的微生物失调对血管表型的贡献，对连续或交替高脂饮食方案的Ldlr-/-小鼠进行抗生素处理（图2c）。尽管抗生素处理耗尽了肠道微生物，但交替高脂饮食仍然加速了动脉粥样硬化发展。这一结果表明，肠道微生物群并未介导交替高脂饮食对动脉粥样硬化的影响。
进一步分析了高脂饮食再暴露是否调节免疫反应。发现交替高脂饮食的小鼠脾脏中Il6和Tnf mRNA水平较高，以及外源刺激的脾细胞产生的IL-6、IL-18和TNF水平较高（图2d-e）。交替高脂饮食组小鼠血液中B细胞略有增加，且脾脏中T细胞和B细胞比例较高（图2f-h）。交替高脂饮食小鼠的动脉粥样硬化斑块中浸润的CD3+ T细胞数量较高（图2i）。为了评估脾脏免疫细胞和淋巴细胞在交替高脂饮食促动脉粥样硬化效应中的贡献，使用两种不同的策略：一种是脾切除法，另一种是基因改造小鼠模型Apoe-/-Rag2-/-。尽管血浆胆固醇水平没有差异，但交替高脂饮食仍然加重了脾切除小鼠及Apoe-/-Rag2-/-小鼠的动脉粥样硬化发展，排除了适应性免疫在交替高脂饮食促动脉粥样硬化中的作用（图2j-m）。
图2 交替高脂饮食独立于肠道微生物群或适应性免疫加速动脉粥样硬化
结果3. 交替高脂饮食与髓系反应
为了揭示交替高脂饮食促动脉粥样硬化效应的机制，在高脂饮食再暴露后1周（两组的斑块大小相似，第13周），收集连续或交替高脂饮食小鼠的主动脉进行RNA-seq分析（图3a）。尽管斑块大小没有明显差异，但主动脉的全转录组特征因交替高脂饮食而显著改变，其中Myeloid cell homeostasis这一生物学过程被显著性富集（图3b）。在重新暴露于高脂饮食后，血液单核细胞计数再次增加，第二次高脂饮食暴露引起的变化与第一次暴露后观察到的变化相似（图3c-e）。
此外，使用scRNA-seq对主动脉的CD45+免疫细胞进行分析，发现单核细胞/巨噬细胞的比例在两组之间没有显著差异。鉴于髓系和氧化应激通路在交替高脂饮食组中上调，因此重点研究了中性粒细胞的作用。在高脂饮食开始后，血液中性粒细胞计数也缓慢增加，并在从高脂饮食切换到常规饲料后下降（图3f-g）。与CD62+中性粒细胞的增加相关，这些观察与高脂饮食再暴露期间CXCL1、CXCL2和CCL3的血浆水平增加一致（这些是调节中性粒细胞迁移的主要趋化因子）（图3h-i）。
scRNA-seq识别了两个中性粒细胞簇（Neutro1和Neutro2），其中Neutro2是一个具有高度促炎特征的细胞簇（高表达Il1a、Il1b、Nlrp3和Tnf），且该细胞簇在交替高脂饮食组中显著富集（图3j）。此外，在交替高脂饮食小鼠中的中性粒细胞胞外陷阱（NET）表现更高（图3k）。为了直接评估交替高脂饮食诱导的急性中性粒细胞增多对动脉粥样硬化的影响，进行anti-Ly6G治疗（图3l）。初步确认，新开发的小鼠抗Ly6G单克隆抗体几乎完全耗竭了循环中性粒细胞，交替高脂饮食的促动脉粥样硬化效应被消除（图3m-p）。总的来说，交替高脂饮食选择性地影响了中性粒细胞的迁移和成熟，从而加速了动脉粥样硬化的发展。
图3 高脂饮食重新暴露诱导急性中性粒细胞增多和NETosis，导致动脉粥样硬化加速
结果4.交替高脂饮食与髓系生成
为了评估骨髓细胞（BM）对交替高脂饮食诱导的动脉粥样硬化加速的贡献，进行了骨髓移植。Ldlr−/−小鼠在6-10周龄暂时暴露于高脂饮食（Exposed）或常规饲料（Non-exposed），然后喂食常规饲料8周（图4a）。Exposed组的骨髓中GMP和中性粒细胞显著增加，且骨髓细胞中Il1b、Il6、Il18和Tnf mRNA水平升高（图4b-e）。
值得注意的是，HFD 再暴露诱导的急性中性粒细胞增多在 Cd36-/-小鼠中得以维持，但在 Myd88-/-和 Tlr4-/-小鼠中被消除（图 4s）。此外，在Re-exposure组中，Myd88-/- 和 Tlr4-/-小鼠 BM 中的 Il1b mRNA 水平显著降低（图 4t）。HFD 再暴露时，TLR4 受体参与了应急髓系造血和骨髓细胞 IL - 1β 的产生，RUNX1 转录因子在调节中性粒细胞的炎症表型中起关键作用，IL-1β 主要由中性粒细胞产生，其受体主要由 GMP 和中性粒细胞表达。
图 4 交替 HFD 诱导 TLR4 依赖的 IL-1β 产生于 BM，负责中性粒细胞祖细胞的重编程
结果5. IL-1β通路阻断
在骨髓移植后4周，Chimeric Ldlr–/–Il1b–/–小鼠被给与交替或连续的HFD喂养（图5a）。在缺乏IL-1β的情况下，交替HFD诱导的急性中性粒细胞增多症被消除（图5b）。虽然连续或交替HFD喂养的小鼠的血浆胆固醇水平相似，但交替HFD加速动脉粥样硬化的作用被消除（图5c-d）。IL-1β下游信号通路的阻断消除了急性中性粒细胞的增多，并消除了由交替HFD诱导的动脉粥样硬化加速（图5f-j）。最后，Ldlr −/−小鼠在连续或交替HFD下接受了anti-IL-1β抗体治疗（图5k）。使用抗 IL-1β 中和抗体或 NLRP3 炎性小体抑制剂 MCC950 也可消除交替 HFD 的促炎和促动脉粥样硬化效应（图5l-n）。
图 5 IL-1β 信号通路阻断消除了交替-HFD诱导的中性粒细胞增多和加速动脉粥样硬化