LiP-MS：研究衰老过程中体内蛋白质丰度与构象变化的强大工具
LiP-MS：研究衰老过程中体内蛋白质丰度与构象变化的强大工具
衰老是一个复杂的生物学过程，伴随着蛋白质组的多层次改变，包括蛋白质丰度的变化、翻译后修饰的积累以及蛋白质结构的改变。近年来，有限蛋白酶解-质谱法（LiP-MS）作为一种新兴技术，为在全蛋白质组范围内观察蛋白质丰度和结构变化提供了强有力的工具。本文将详细介绍LiP-MS技术在研究体内蛋白质变化中的应用方法，包括样本处理、实验设计、数据分析和结果解读等关键步骤。
生物体内蛋白质的丰度和结构变化受到多层次的精细调控。蛋白质丰度主要通过转录、翻译和降解过程进行调控，而结构变化则受翻译后修饰、配体结合、环境条件以及蛋白质相互作用等多种因素影响。这些变化在细胞信号传导、代谢调控、应激反应和细胞周期等生物学过程中发挥关键作用，使细胞能够动态适应内外环境的变化并执行特定功能。
衰老是一个复杂的生物学过程，伴随着蛋白质组的多层次改变，包括蛋白质丰度的变化、翻译后修饰的积累以及蛋白质结构的改变。这些变化可能导致蛋白质功能失调、细胞稳态失衡以及组织功能的衰退。例如，在衰老过程中，错误折叠蛋白质的积累与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的发生密切相关。因此，深入研究蛋白质随年龄变化的动态特征，对于揭示衰老机制和开发抗衰老策略具有重要意义。
近年来，有限蛋白酶解-质谱法（Limited Proteolysis–Mass Spectrometry, LiP-MS）作为一种新兴技术，为在全蛋白质组范围内观察蛋白质丰度和结构变化提供了强有力的工具。该技术通过结合有限蛋白酶解和高灵敏度质谱分析，能够同时捕捉蛋白质丰度的变化和结构动态，极大地推动了我们对体内蛋白质功能调控和疾病机制的理解。接下来，我将详细介绍LiP-MS技术在研究体内蛋白质变化中的应用方法，包括样本处理、实验设计、数据分析和结果解读等关键步骤，以期为相关领域的研究者提供参考和帮助。
LiP-MS技术通过结合有限蛋白酶解和高灵敏度质谱分析，能够同时检测蛋白质丰度和结构的变化。其核心原理如下：
- 有限蛋白酶解：在温和条件下，使用非特异性蛋白酶（如蛋白酶K）对蛋白质样品进行部分酶解。蛋白质的结构状态决定了其酶切位点的可及性，因此结构变化会反映在酶切模式的差异上。
- 质谱分析：通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对酶解后的肽段进行分析，获得蛋白质的酶切图谱。
- 数据分析：通过比对不同年龄样本中蛋白质的酶切模式和丰度变化，识别出与年龄相关的蛋白质结构改变和功能失调。
LiP-MS在年龄相关蛋白质变化研究中的应用
1 揭示蛋白质构象随年龄的变化
随着年龄增长，蛋白质的折叠状态可能发生改变，导致错误折叠或聚集。LiP-MS能够捕捉这些构象变化，例如在衰老过程中，分子伴侣蛋白的功能下降可能导致蛋白质错误折叠的增加。通过LiP-MS技术，可以识别这些变化并研究其与衰老相关疾病的关系。
2 研究翻译后修饰的积累
衰老过程中，蛋白质翻译后修饰的积累可能改变蛋白质的结构和功能。LiP-MS可以检测这些修饰引起的局部构象变化，从而揭示修饰对蛋白质功能的影响。
3 探索衰老相关蛋白质的功能失调
LiP-MS能够同时检测蛋白质丰度和结构的变化，为研究衰老过程中蛋白质功能失调提供了全面的视角。例如，在衰老的肌肉组织中，肌动蛋白和肌球蛋白的结构变化可能导致肌肉功能的衰退。
4 发现衰老相关生物标志物
通过比较年轻和老年样本中蛋白质的酶切模式和丰度变化，LiP-MS可以帮助识别与衰老相关的生物标志物。这些标志物不仅有助于理解衰老机制，还可能为抗衰老干预提供潜在靶点。
LiP-MS在衰老研究中的实例
衰老是神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的主要风险因素，深入理解大脑衰老的机制对于揭示这些疾病的发病机理至关重要。蛋白质的结构变化在衰老和疾病中扮演着关键角色，然而，此前尚未在哺乳动物系统中进行高通量的蛋白质结构变化筛查。脑脊液（CSF）中含有与阿尔茨海默病相关的蛋白质形式和复合物，因此，研究CSF蛋白质的丰度和结构变化有望为理解衰老和神经退行性疾病提供新的见解。
该文章采用LiP-MS对衰老过程中脑脊液（CSF）蛋白质的丰度和结构变化进行了系统研究。研究发现，38个蛋白质组在衰老过程中丰度发生变化，尤其是IgM亚类的免疫球蛋白显著增加。此外，研究还鉴定出6个高置信度的蛋白质在衰老过程中发生结构变化，其中一些与阿尔茨海默病（AD）密切相关。通过Western blot验证，Cd5l与IgM形成共价复合物，且其丰度随衰老显著增加。在人类CSF中，这些蛋白质的变化与认知功能和神经退行性疾病的生物标志物密切相关，特别是14-3-3蛋白（YWHAB和YWHAZ）。本研究展示了LiP-MS技术在揭示与衰老和神经退行性疾病相关的蛋白质结构变化方面的巨大潜力。
参考文献：Shuken SR, Rutledge J, Iram T, et al. Limited Proteolysis-Mass Spectrometry Reveals Aging-Associated Changes in Cerebrospinal Fluid Protein Abundances and Structures [published correction appears in Nat Aging. 2022 May;2(5):455. doi: 10.1038/s43587-022-00225-9]. Nat Aging. 2022;2(5):379-388. doi:10.1038/s43587-022-00196-x