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特征选择策略：为检测乳腺癌生物标志物寻找新出口

创作时间:

作者:

@小白创作中心

特征选择策略：为检测乳腺癌生物标志物寻找新出口

引用

来源

https://hyper.ai/cn/news/24589

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率高居女性恶性肿瘤之首。随着治疗手段的不断提高，早期乳腺癌五年生存率可达到90%甚至更高。因此，乳腺癌早期的准确诊断尤为重要。

microRNA（小分子核糖核酸）是一类短小的单链非编码RNA转录体。这些分子在多种恶性肿瘤中呈现失控性生长，因此近年来被诸多研究确定为确诊癌症的可靠的生物标志物（biomarker）。在多种病理分析中，差异表达分析（Differential Expression Analysis）常被视为检测关键生物标志物的有效方法，而来自意大利那不勒斯费德里科二世大学的研究人员，则提出基于机器学习的特征选择（Feature Selection）策略能够更为有效的检测，并建议将其发现的20种microRNA作为乳腺癌诊断性生物标志物。

实验概述

在本研究中，科研人员发现借助3种特征选择方法（增益率、随机森林及支持向量机递归特征消除），可以更加高效地提取诊断分子组合，他们揭示了一个包含20个microRNA的组合(panel)，其中hsa-mir-337、hsa-mir-378c以及hsa-mir-483在目前的乳腺癌诊断生物标志物中，暂未受到医学界的广泛关注。该方法能够区分健康及肿瘤样本，与常用的差异表达法相比，其分类性能更佳，更容易识别易被低估甚至忽略的特征。

图 1: Pipeline 概述

Workflow 包含4个关键步骤：

(i) 在训练TCGA子集上进行Ensemble-FS计算
(ii) 对TCGA/GEO数据集进行差异表达分析
(iii) 比较差异表达分析和特征选择结果的分类性能，并评估特征选择方法的稳定性
(iv) 用计算机模拟验证所选signature的前20种microRNA，对枢纽基因靶点进行检测。

实验详情

数据集

实验数据来源包含两个渠道：美国GDC官网的TCGA-BRCA项目以及Gene Expression Omnibus (GEO) data repository (GSE97811) 。

实验团队从GDC TCGA-BRCA项目中，合计收集了1,881个microRNA-Seq数据，并按照8:2的比例，分成了训练集和测试集两部分。这些数据与300个实体原发肿瘤样本(T)以及101个正常相邻肿瘤(NAT)样本相关，都属于导管及小叶乳腺组织。应用特征选择法之前，这些数据都进行了方差稳定归一化处理(variance stabilizing normalization) 。

同时，科研人员从GEO数据库(GSE97811)下载了一个包含2,565个microRNA的微阵列数据集(microarray dataset)，作为本次实验的验证集。该数据集包括16个正常样本及45个肿瘤样本，然后进行数据插补(data imputation) 。

由于GEO数据（本实验中的验证集）涉及到的是成熟microRNA表达，TCGA数据（本实验中的训练集和测试集）则包含早期形态(precursor form)，为了统一数据，科研人员在GEO数据样本中只选择了平均计数值高于其对立链(opposite strand)的可替代成熟microRNA；同时,microRNA的名称也已经转换成了相应的早期形态名称。

通过这一过程后，GEO数据（验证集）的维度减少至1,361个microRNA，相应的TCGA RNA-Seq数据也被收集，共包括20,404种基因。

特征选择法及Ensemble程序应用

科研人员选择了3种特征选择方法与差异表达分析法进行比较，分别是Gain Ratio（增益率）、Random Forest（随机森林）和SVM-RFE（支持向量机递归特征消除）。将3种方法应用于microRNA-Seq表达TCGA数据的500个子集上，以识别能区分正常样本和肿瘤样本的稳健特征面板(panel) 。观察到的结果中，按照8:2的比例划分为训练集和测试集，然后对数据通过重采样(resampling)进行自助法(bootstrapping)处理，使其符合数据扰动集成程序(Data Perturbation Ensemble procedure) 。每次计算返回的500个按「importance score」降序排列的microRNA向量。

**｜备注：**importance score（重要性得分）表示用算法计算得出的每个feature（特征）在分类中的影响。importance score越高，赋予feature的rank就越低。然后科研人员通过一个聚合程序，推导出每种特征选择方法的共识签名(consensus signature)，最终每组microRNA保留得分前200名的feature 。

稳定性测试

用Kuncheva Index (KI) 和Percentage of Overlapping Gene/Features (POG)评估特征选择方法的一致性，用Stot统计法（KI的成对测量）确定所有方法之间的稳定性。这些统计数据是在signature长度逐渐增加的过程中计算得出的，feature数量从2开始到200结束，每次重新计算增加2个unit 。

Stot统计法公式

差异表达分析和DE-signature

对TCGA数据集（含microRNA-Seq及RNA-Seq）进行差异表达分析，从原始计数(raw count)开始，使用精确检验(Exact Test)，然后保留FDR <= 0.01及Log2FC阈值为|0.5|的DE feature 。为了获得DE-microRNA的signature，将Log2FC值转化为绝对值，并按照abs(Log2FC)递减的顺序对microRNA（保留前200个feature）进行排序。

GEO验证集借助Limma进行差异分析表达，该数据集获取DE-signature的参数及程序与TCGA数据集一致。

分类性能分析

为了确定每个signature区分健康人及癌症患者的能力，科研人员在测试子集(TCGA)和验证集(GEO)上对4个signature（包括特征选择panel和差异表达panel）都进行了预测性分析。

最后计算出精度平均值(ACC)、K统计量(KK)以及马修斯相关系数(MCC)在各个fold以及每个signature的多个长度上的平均值。

SVM-RFE microRNA-signature靶点(target)检测

为了识别microRNA潜在的基因靶点，科研人员进行了以下操作：

将前20个SVM-RFE microRNA按照其在肿瘤样本中的上调(up-regulated)或下调(down-regulated)进行分类。
对RNA-Seq数据进行差异表达分析，检测差异表达基因(FDR <= 0.05) 。
应用斯皮尔曼相关性分析，对比microRNA表达与差异表达基因，只保留与down-microRNA负相关的up-gene，以及up-microRNA负相关的down-gene (rho <= -0.5) 。
收集所有经过验证的microRNA基因靶点(gene targets)，且只保留那些也显示出DE-correlated的。

网络中心性及枢纽基因识别

选定失调基因的相关矩阵(Spearman)，并用其构建一个图结构基因网络：保留Kleinberg’s hub中心性得分>75，rho > 0.8或rho < -0.6的枢纽基因。对枢纽基因进行基因富集分析(ORA)，以便从REACTOME数据库中探索最丰富的pathway 。FDR调整后pValue值阈设定为0.005 。

实验结果

实验表明，应用3种特征选择方法后，都返回了500个按importance score降序排列的microRNA signature，汇总后得到3个共识panel 。值得注意的是，排名前3的microRNA（hsa-mir-139、hsa-mir-96及hsa-mir-145）在所有panel中都出现了，显示出这些分子在区分肿瘤样本和健康样本中的重要性。

｜结论 1：SVM-RFE稳定性最高

从KI和POG在共识panel上的计算来看，SVM-RFE法最具稳定性，signature长度达到20个feature时最突出。同样，Stot指数的结果也显示出SVE-RFE法具有最高稳定性。

图 2: 3种特征选择方法的稳定性指数比较

蓝色：Random Forest（随机森林）
粉色：Gain Ratio（增益率）
黄色：SVM-RFE（支持向量机递归特征消除）

｜结论 2:SVM-RFE signature在分类中的表现优于差异表达signature

所有单独panel进行分类性能分析后，无论是测试集(TCGA)还是验证集(GEO)，都显示出用SVM-RFE获得的signature的预测能力最高。

图 3: 前20个microRNA分类性能及维恩图

A：条形图显示了在测试子集和外部验证GEO数据集上计算的平均statistic
ACC：精度
KK：K统计量
MCC：马修斯相关系数
绿色：DE（差异表达分析法，该实验中的对照方法）
粉色：GR（增益率）
蓝色：RF（随机森林）
橙色：RFE（SVM-RFE，支持向量机递归特征消除）
B：每个signature的前20个microRNA的维恩图，其中标注了SVM-RFE panel前20中的一些有趣的microRNA–hsa-mir-337、hsa-mir-378c及hsa-mir-483，这3个micro-RNA在3种特征选择方法中都出现了，但目前关于乳腺癌的研究中尚未完全确定其作为诊断依据是否可靠。

｜结论 3: 网络分析揭示了疾病演变中的潜在关键基因

实验表明，CDC25、TPX2及KIF18B在不同类型癌症以及三阴性乳腺癌患者的干细胞中，都显示高度表达，且TGFBR2的下调与癌症进展相关。