细胞自噬(Autophagy)

细胞自噬(Autophagy)

细胞自噬（Autophagy）是细胞内一种重要的自我降解和循环利用机制，对于维持细胞内环境稳定、应对各种应激状态以及参与多种生理病理过程具有重要作用。本文将详细介绍细胞自噬的过程、核心调控基因以及常用的检测方法。

自噬过程

1. 步骤1：Phagophore的形成
   细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

2. 步骤2：自噬体的形成
   Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有两个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

3. 步骤3：自噬体与溶酶体的融合
   自噬体形成后，可与细胞溶酶体发生融合（这种情况不是必然要发生的）。

4. 步骤4：自噬溶酶体的形成与降解
   自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬核心调控基因

• 正向调控基因：LC3、ATG5、ATG7、Beclin 1、Other ATG family proteins。
• 负向调控基因：无。
• 释放损伤相关分子：HMGB-1。
• 免疫特征：抗炎为主。

自噬的检测

1. 透射电镜检测

• Phagophore的特征：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。
• 自噬体(AV1)的特征：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。
• 自噬溶酶体(AV2)的特征：单层膜，胞浆成分已降解。

自噬透射电镜图

2. Western Blot检测标志物

• LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。

WB检测自噬标志物图

3. LC3-II/I比值的变化
   自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

4. p62蛋白水平检测
   p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。

5. mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统检测
   mRFP-GFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。

LC3自噬双标系统追踪自噬流不同阶段

mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统检测感染细胞效果图