手把手教学：琼脂糖凝胶电泳的实验步骤及常见问题分析
手把手教学：琼脂糖凝胶电泳的实验步骤及常见问题分析
实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
实验步骤
1. 配胶
首先根据DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度，称取相应质量的琼脂糖粉末于TAE/TBE缓冲液中溶解，微波加热1min左右取出（时间根据体积改变），加入Gelred染料，摇晃均匀后倒入模具。
注：缓冲液为三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）或三硼酸-EDTA（TBE），三酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液，可保持DNA去质子化并溶于水。EDTA是一种螯合剂，能使可能损害被分析的DNA的核酸酶失活。
2. 凝胶浇注
选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳齿。轻柔地将加了染料的琼脂糖凝胶溶液倒入模具中，观察有无气泡产生，在胶未完全凝固的时候戳破，否则会影响最终结果。注：速度不可太快，否则容易出现气泡。
3. 将样品与DNA loading buffer混合
将样品与含溴酚蓝的loading buffer混合，loading buffer可以帮助我们观察样品的位置。
4. 凝胶装入
待胶变硬，直到呈乳白色且不透明（约20-30 min），小心地垂直拔出梳齿，将胶块放入电泳槽中，确保孔位于负电极（一般为黑色），将运行缓冲液（TAE或TBE）注入槽中，使凝胶被淹没1-2 mm。用移液器向泳道中加样，不要超过泳道载量，否则样品会溢出。
5. 凝胶运行
确保电极没有插反，否则样品会跑到缓冲液中。设定凝胶运行的时间和电压，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极，电泳时间30-60 min，具体根据凝胶比例和片段大小进行调整（一般120V，35 min即可）。电泳结束后，拔掉电源。
常见问题分析
1. 加样孔有荧光
（1）提DNA时有蛋白质残留。
（2）基因组DNA，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，滞留在加样孔中产生荧光。
2. 条带扭曲呈波浪状
（1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。
（2）电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压（3 V/cm），等条带出孔后，再调电压。
（3）慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。
3. 条带弥散
（1）DNA发生降解。
（2）电泳缓冲液陈旧（根据DNA Maker对照，观察是否为电泳体系的问题）。
（3）PCR过程产生非特异性的扩增 （使用特异性较高的引物）。
参考资料：