什么是flox/flox小鼠？实验后如何验证基因敲除效果？
什么是flox/flox小鼠？实验后如何验证基因敲除效果？
flox/flox小鼠是基因工程中常用的一种实验小鼠模型，它们通过Cre-Lox系统为研究人员提供了在特定时间和空间条件下敲除或调控基因的能力。这种模型在研究特定基因功能、疾病机制以及药物筛选等方面具有重要应用。本文将详细介绍flox/flox小鼠的概念、原理及其在基因敲除实验中的应用，并介绍实验后验证基因敲除效果的各种方法。
flox/flox基因型
flox/flox表示该基因座为双重flox，即两个等位基因都带有flox位点。这些位点使得表达Cre酶的组织或细胞可以特异性地将floxed基因删除。
与KO小鼠的区别
与全身基因敲除的KO小鼠不同，flox小鼠（也称为CKO小鼠）是条件性基因敲除小鼠。在flox小鼠中，目标敲除片段的首尾各插入了一段loxp序列，从而允许在特定条件下进行基因敲除。
Cre-Lox系统原理
Cre重组酶最初在P1噬菌体中发现，能特异性识别loxP位点，并介导两个loxP位点之间的DNA序列进行重组。在Cre-loxP系统中，携带loxP位点的小鼠（即Floxed小鼠）与Cre小鼠交配后，可以在特定组织或细胞中实现基因敲除或表达。
应用
flox/flox小鼠广泛应用于科学研究，特别是在研究特定基因在不同组织或细胞中的作用时。通过组织特异性Cre小鼠与flox/flox小鼠交配，可以在特定组织中实现基因的敲除或过表达，从而深入理解基因功能。
实验后如何验证基因敲除效果
以下是一些常用的验证手段：
PCR和DNA测序
- 聚合酶链反应（PCR）：使用特定的引物来扩增目标基因区域，如果基因敲除成功，扩增产物的大小会发生变化，或者无法扩增出目标片段。
- DNA测序：对PCR产物进行测序，以确认loxP位点是否正确插入，以及目标基因序列是否被删除。
RT-PCR和qRT-PCR
- 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：用于检测基因敲除后mRNA水平的变化。如果基因被成功敲除，相应的mRNA水平会显著降低或无法检测到。
- 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）：可以定量分析基因敲除后mRNA的表达水平。
Western blot
通过Western blot可以检测蛋白质水平的变化。如果目标基因被成功敲除，相应的蛋白质表达水平会降低或消失。
免疫组化或免疫荧光
这些技术可以用来检测特定蛋白质在细胞或组织中的分布和表达情况。如果基因敲除成功，相应的蛋白质信号会减弱或消失。
功能测试
对敲除基因的功能进行直接测试，例如通过细胞增殖、凋亡、迁移等实验来评估基因敲除对细胞功能的影响。
表型分析
对实验动物进行详细的表型分析，包括形态、行为、生理和生化特性的变化，以确定基因敲除是否导致了预期的表型改变。
报告基因活性检测
如果敲除的基因旁边插入了报告基因（如荧光蛋白），可以通过检测报告基因的活性来间接验证基因敲除的效果。
每种方法都有其优势和局限性，通常需要结合多种方法来全面验证基因敲除的效果。