高效液相色谱技能篇|关于内标法的小知识

高效液相色谱技能篇|关于内标法的小知识

高效液相色谱（LC）是一种常用的分离和定量分析技术，在药物、食品、环境等领域的检测中发挥着重要作用。内标法是LC定量分析中常用的一种方法，通过向样品中添加已知量的内标物质，可以有效补偿样品制备和分析过程中的变异，提高分析结果的准确性和精密度。本文将详细介绍内标法的基本原理，并对比中国、欧洲和美国药典中内标法的具体应用和差异。

中国药典中的内标法（2025版的公示稿）

内标法的一般步骤（可以理解为内标单点法）

1. 精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液；

2. 精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液；

3. 精密量取适量进样，记录色谱图；

4. 测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

5. 再精密量取各品种项下含有内标物质的供试品溶液适量，进样，记录色谱图；

6. 测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

对于成分复杂或待测成分含量变化较大的药物体系，可以采用内标标准曲线法进行含量测定。

1. 精密称取对照品（或工作对照品）适量，或精密量取对照品储备液适量，与精密量取的内标溶液混合，配成含等量内标物的不同浓度待测成分的系列溶液，
2. 精密量取系列溶液各适量，进样，记录色谱图，
3. 测量待测成分和内标物的峰响应比值，用峰响应比值（或经转换）对待测成分浓度绘制标准曲线，通过最小二乘法计算出回归曲线方程。
4. 在相同的色谱条件下，再精密量取加有与对照品系列溶液相同量内标物的供试品溶液，进样，记录色谱图，
5. 测量供试品溶液中待测成分和内标物的色谱峰响应比值，由待测成分的峰响应比值（或经转换）和回归曲线方程确定供试品溶液中待测成分的量。

欧洲药典中的内标法

使用校准函数的多点校准：

1. 选择一个稳定的内标物质，其保留时间应接近待测组分，并且其峰应与色谱图中所有其他峰良好分离。
2. 制备一系列含有固定量内标和不同梯度浓度对照品的参考溶液。
3. 注入固定体积的各个参考溶液，记录色谱图，并计算对照品与内标峰面积或峰高的比例。
4. 绘制校准曲线，横坐标是对照品的量（或对照品与内标量的比值），纵坐标是峰面积或峰高的比例。
5. 通常通过线性回归得到校准函数。
6. 制备含有与校准函数制备中相同量内标的待测样品溶液，并在相同色谱条件下分析，计算待测组分与内标的比例，通过校准函数读取或计算组分的含量。

单点校准：

1. 在各论中，选择一个浓度在校准曲线线性范围内的对照品溶液，以及一个浓度接近该对照品溶液的待测样品溶液（两者都含有固定量的内标）。
2. 在固定条件下进行色谱分析，通过比较得到的峰面积或峰高比例来定量分析组分的含量。

图1.欧洲药典内标法原文

美国药典中的内标法

使用校准函数的多点校准：

1. 选择一个稳定的内标物质，其保留时间应接近待测组分，并且其峰应与色谱图中所有其他峰良好分离。
2. 制备一系列含有固定量内标和不同梯度浓度对照品的参考溶液。
3. 注入固定体积的各个参考溶液，记录色谱图，并计算对照品与内标峰面积或峰高的比例。
4. 绘制校准曲线，横坐标是对照品的量（或对照品与内标量的比值），纵坐标是峰面积或峰高的比例。
5. 通常通过线性回归得到校准函数。
6. 制备含有与校准函数制备中相同量内标的待测样品溶液，并在相同色谱条件下分析，计算待测组分与内标的比例，通过校准函数读取或计算组分的含量。

单点校准：

1. 在各论中，选择一个浓度在校准曲线线性范围内的对照品溶液，以及一个浓度接近该对照品溶液的待测样品溶液（两者都含有固定量的内标）。
2. 在固定条件下进行色谱分析，通过比较得到的峰面积或峰高比例来定量分析组分的含量。

标准化程序：

如果已经证明峰的线性关系，个别各论可能会规定通过测定相应峰的面积占所有峰总面积的百分比（不包括溶剂、试剂或流动相或样品基质引起的峰，以及忽略限或报告阈下的峰）来计算待测组分的百分比含量。

图2.美国药典内标法原文

对三国药典进行总结一下：

共同点：

• 三种药典都强调了内标物的选择标准，即内标物应稳定，其保留时间应接近待测组分，并且其峰应与色谱图中所有其他峰良好分离。
• 都采用了校准曲线的方法来定量分析，无论是通过多点校准还是单点校准。
• 都涉及到了通过测量峰面积或峰高来计算校正因子和待测组分的含量。

差异点：

• 中国药典在公示稿中没有详细描述单点校准（但一般可以默认最开始的是单点校准法）和标准化程序；
• 欧洲药典和美国药典都明确区分了多点校准和单点校准，并且美国药典提供了标准化程序的描述，允许在特定条件下通过峰面积百分比来计算含量。