微生物气体发酵法转化H2/CO2气体产乙酸的研究

微生物气体发酵法转化H2/CO2气体产乙酸的研究

随着工业的快速发展，废气排放量逐年增加，尤其是冶金行业产生的废气，主要成分为CO、CO2、H2等。天然耗氢产乙酸菌具有特殊的厌氧乙酰-CoA途径，可以利用氢解酶将H2转化为[H+]产生电子，再把2分子的CO2还原成乙酸的甲基和羧基。本研究从活性污泥中筛选得到一株耗氢产乙酸菌WJL142，通过优化发酵条件，实现了H2/CO2气体向乙酸的高效转化。

实验材料和方法

本实验发酵菌种为耗氢产乙酸菌WJL142，从兰州市皋兰县污水处理厂二级沉淀池的污泥中筛选得到。

5L 磁力搅拌发酵罐气体发酵实验装置

本实验采用5 L磁力搅拌发酵罐(型号HVE-50，上海保兴生物科技公司)，进行气体发酵产乙酸实验，其容积为5L，玻璃管体，工作压力<0.1MP。该发酵罐具有温度、转速、空气流量、pH、DO、补料、消泡显示及控制功能，并且还配有空气过滤器及机械消泡浆。本实验中发酵罐初始温度设置为37℃，转速设置为100r/min，灭菌方式为高温蒸汽灭菌锅灭菌(121℃，30min)。发酵装置如图1所示。

发酵种子液的制备

首先配备500mL种子培养基，种子培养基的配方为：CHNaO2·2H2O 3.25 g/L， KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25g/L， MgCl2·H2O 0.3 g/L， FeCl30.25 g/L，NiSO40.016 g/L，ZnCl20.0116 g/L，CoCl·6H2O 0.0102 g/L，CuCl2·2H2O 0.005 g/L，MnCl2·4H2O 0.015 g/L。配好后用0.25M的NaOH溶液调整pH值为7，加入锥形瓶中，然后用带有玻璃管的橡胶塞塞住瓶口，再将玻璃管用锡箔纸进行密封，将其放入灭菌锅中，在121℃温度下灭菌20min。灭菌完成待冷却至常温后，将其放入无菌处理后的超净工作台中。取出活化的耗氢产乙酸菌WJL142平板，吸取200μL无菌水冲刷平板上的菌落，将菌液接入灭菌冷却后的锥形瓶培养液中，反复进行3～5次。再将锥形瓶用橡胶塞密封，从被锡箔纸密封的玻璃管口处插入灭菌处理过的长针头。轻轻来回摇晃锥形瓶，使接入的菌液和种子培养基充分混合，再放入如图2所示的通气摇床中，37 ℃恒温，持续通入CO2/H2，静止培养一定时间即得到发酵种子液。

5L发酵罐气体发酵实验方法

首先配制发酵培养基4L，发酵培养基即在种子培养基中加入4g/L二溴乙烷磺酸钠(BES)，用以抑制甲烷的生成。将发酵培养基装入清洗后的发酵罐后，采用pH值为4.0和6.18两种标准溶液进行pH电极校正。用锡箔纸将滤菌膜、pH电极接头以及各管路开口处密封，在尾气排放口处，连接一个漏斗，用纱布和报纸将其包裹，将发酵罐放入灭菌锅中，除尾气排放口及平衡管外，其余管路全部密封，在121℃下，灭菌20min。

灭菌结束，待发酵罐冷却后，转移至发酵工作台，连接冷却水管路、尾气冷凝管路、温度计、pH电极。打开通气管路及冷却水。打开发酵罐主控制台，设置各发酵参数如发酵温度37℃、转速100r/min等。待发酵罐各参数到达预期发酵参数后，开始接种，在接种环火焰保护下，快速将种子液接入发酵罐，拧紧接种口，移去接种环。发酵过程中，约每两个小时取一次样。取样时，将取样管打开，并夹住尾气排放管和平衡管，用10mL无菌离心管接取发酵液。

乙酸检测方法

本实验采用高效液相色谱(L-2400 UV Detector，Hitachi)进行乙酸检测。选用XAqua C18色谱柱(5μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为0.2 %(V/V)磷酸和乙腈混合溶液(体积之比为96.5∶3.5)，流速为1 mL/min，紫外检测波长为214 nm，乙酸的保留时间为4.222 min，工作曲线方程为y=10-4x+0.0853(y：乙酸摩尔浓度，x：乙酸峰面积)，相关系数R2=0.9912。发酵样品6000r/min离心10min，取3.5mL上清液，用0.45μm滤菌膜过滤后待用。

实验结果与讨论

氮源对耗氢产乙酸菌WJL142发酵产酸的影响

氮是构成细胞中核酸和蛋白质的主要元素之一，细菌细胞中氮占12%～15%，是微生物生长代谢过程中不可缺少的营养物质。采用耗氢产乙酸菌进行气体发酵，CO2是唯一碳源，所以适当添加有机氮源能够促进细胞生长，提高产酸量。本实验选用酵母粉作为WJL142气体发酵的氮源。进行了5批次的梯度发酵实验，酵母粉加入量分别为1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、10g/L，发酵温度37℃，将H2/CO2以4mL/min、8mL/min的速率通入培养基，发酵24h后取样，用HPLC检测发酵液中的乙酸含量，最终实验结果如图4所示。实验结果表明，当酵母粉加入量为2g/L时，乙酸产量相对较高，约为32.38mM。在以后的单因素实验中，发酵培养基中均加入2g/L的酵母粉。

发酵温度对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

生长温度是影响细胞生长的重要因素，适宜的培养温度能提高代谢过程中酶的催化效率。本研究选取了40℃和37℃两种温度，培养种子液和发酵液，进行了四次不同温度组合的发酵实验。发酵过程中均采用4ml/min、8ml/min的速率通入H2/CO2，培养基中添加2g/L的酵母粉，发酵24小时后，测定乙酸含量。实验结果如图5所示，最终实验结果表明，当种子液和发酵培养温度都为37℃时，耗氢产乙酸菌生长产酸效果最好，产酸量达到38.21mM。

CO2/H2通气量对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

本实验的研究目的是以CO2/H2为底物，利用耗氢产乙酸菌的厌氧-CoA代谢途径转化为乙酸，所以CO2是发酵过程中的唯一碳源，CO2/H2的通入量直接影响最终的乙酸含量。在实验过程中，分别采用CO2/H2通气量为3mL/min和6mL/min；4mL/min和8mL/min；5mL/min和10mL/min；6mL/min和12mL/min；7.5mL/min和15mL/min。在发酵温度为37℃，以2g/L酵母粉为氮源的条件下发酵培养24小时。利用高效液相色谱检测发酵液中的乙酸含量，通过图6分析处理对比可知，当H2和CO2通气量分别为5mL/min和10mL/min时，耗氢产乙酸菌发酵产酸含量相对较高约为38.47mM左右。

接种方式对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

种子液成熟度的影响

本实验的目的是为了研究种子液培养时间对WJL142发酵产酸的影响，先后进行了5组实验，种子液培养时间分别为6h、8h、10h、12h、24h。发酵过程中在预定时间内取样检测，图8为采用不同成熟度的种子液进行发酵产生的乙酸变化曲线，很明显，种子液培养8h后接入发酵罐乙酸菌增殖代谢最佳，能够产生31.7mM的乙酸。

接种量的影响

微生物接种量的多少直接会影响最终产物的生成。为研究接种量对WJL142产酸的影响，将培养8h的种子液，分别按照7%、10%、12%、14%的接种量接入发酵培养基，按照预定时间进行取样，检测样品中的乙酸含量。最终结果如图7所示，当接种量为10%，即种子液和发酵培养基比例为1∶10的条件下，乙酸菌WJL142的发酵代谢产酸情况最好，发酵45h乙产酸量达到40.9mM。

最优条件下耗氢产乙酸菌WJL142产酸情况

通过以上实验，了解了各影响因素对WJL142发酵代谢产酸的影响，为验证在最优条件下耗氢产乙酸菌WJL142发酵产酸情况，先后进行了3组实验。首先在发酵罐中添加2g/L的酵母粉，然后将37℃培养8h后的种子液，按照10%的比例接入到发酵罐中，发酵温度同样设置为37℃，分别以5mL/min和10mL/min通入H2和CO2，按照预定的时间进行取样，并对样品进行预处理后，检测其中的乙酸含量。发酵液pH值变化如图9，最终的pH值降至4左右，整个发酵过程中的产酸量变化如图10所示，从图中可以看出，在最优条件下发酵24h后，WJL142乙酸产量可以达到41.6mM。

图9发酵液pH值变化曲线

图10 WJL142发酵乙酸含量变化曲线

结论

本研究在活性污泥中发现了一种耗氢产乙酸菌WJL142，它具有特殊的厌氧乙酰-CoA代谢途径，能将H2和CO2转化为乙酸。实验采用5L磁力搅拌发酵罐进行模拟废气发酵实验，实验中探究了影响耗氢产乙酸菌WJL142产乙酸的多种因素，包括：氮源、发酵温度、CO2/ H2通气量和接种方式。实验结果表明，耗氢产乙酸菌WJL142最佳发酵条件是，以2g/L的酵母粉为氮源，种子液培养要培养8h，培养温度为37℃，并按照10%的比例接入到发酵罐中，发酵温度同样设置为37℃， H2和CO2分别以5mL/min和10mL/min通入发酵罐中，发酵24h后，乙酸产量能达到41.6mM。