全球首次！中科院和武汉大学联合发布肿瘤微环境细胞胆固醇图谱
全球首次！中科院和武汉大学联合发布肿瘤微环境细胞胆固醇图谱
肿瘤微环境中的免疫细胞可决定肿瘤的发生与发展命运，如肿瘤浸润淋巴细胞TIL可识别并杀伤肿瘤细胞，而肿瘤相关巨噬细胞TAM则可抑制免疫功能。
T细胞进入肿瘤微环境后会发生耗竭和失能，降低其杀伤和清除肿瘤的效能。慢性抗原刺激和肿瘤微环境引发的代谢变化均可造成上述T细胞耗竭和失能。
胆固醇是细胞膜结构的主要成分。前期研究表明，调控T细胞的胆固醇代谢可增强其抗肿瘤能力。但肿瘤微环境中免疫细胞的胆固醇代谢状态、肿瘤浸润淋巴细胞胆固醇水平、胆固醇代谢失衡是否会影响肿瘤浸润淋巴细胞功能等关键问题尚未阐明。
2023年5月26日，中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所/中国科学院分子细胞科学卓越中心许琛琦及武汉大学宋保亮共同通讯在 Cancer Cell 期刊在线发表题为“Exhaustion-associated cholesterol deficiency dampens the cytotoxic arm of antitumor immunity”的研究工作，该工作首次分析了肿瘤微环境中的胆固醇图谱，揭示肿瘤内T细胞胆固醇缺乏，而肿瘤细胞和抑制免疫的骨髓细胞胆固醇富集；低胆固醇代谢水平可抑制细胞毒性T细胞增殖并引发自噬介导的细胞凋亡。
图源：Cancer Cell 官网
肿瘤微环境中胆固醇代谢图谱
研究人员首先使用B16F10黑色素瘤模型和MC38结直肠癌模型绘制肿瘤微环境中不同类群细胞的胆固醇代谢图谱，单细胞测序和脂蛋白摄取实验结果证实肿瘤浸润淋巴细胞存在胆固醇缺乏，而免疫抑制型髓系细胞和肿瘤细胞具有丰富的胆固醇并消耗了大部分环境胆固醇。在人肝细胞癌HCC 肿瘤微环境观察到与上述小鼠肿瘤模型一致的结果。这一结果提示TIL在肿瘤微环境中摄取胆固醇能力较低，胆固醇代谢状态可能影响肿瘤浸润淋巴细胞功能。
图源：Cancer Cell 官网
T细胞活化可影响胆固醇摄取。为将T细胞活化对胆固醇摄取的影响与肿瘤微环境对T细胞胆固醇水平的影响区分开，研究人员随后设计了肿瘤过继转移实验。过继性转移后第5天，肿瘤浸润OT-I-T细胞胆固醇水平显著低于疫苗活化OT-I-T细胞，证实肿瘤微环境可导致TIL中胆固醇缺乏。
胆固醇缺乏导致肿瘤微环境中CD8+T细胞耗竭，而非CD4+T细胞
研究人员进一步研究了胆固醇缺乏TILs功能改变。通过Scapflox/flox 小鼠与Cd4cre小鼠杂交（ScapCKO）实现T细胞中特异性敲除SCAP（SREBP2激活蛋白）抑制T细胞的胆固醇获取。移植MC38肠癌细胞后，ScapCKO小鼠肿瘤比WT小鼠肿瘤生长更快且生存状态更差。在肿瘤微环境中，ScapCKO小鼠CD8+T细胞数量显著减少，但不影响CD4+T细胞数量。
图源：Cancer Cell 官网
CD8+T细胞比CD4+T细胞胆固醇代谢更活跃
进一步研究发现，相比于CD4+T细胞，CD8+T细胞胆固醇代谢水平更为活跃，且对胆固醇缺失引发的增殖抑制和细胞自噬介导的细胞凋亡更为敏感。上述结果提示胆固醇缺失导致肿瘤微环境中CD8+T细胞耗竭，而非CD4+T细胞耗竭。
图源：Cancer Cell 官网
CD8+T细胞比CD4+T细胞更易受到胆固醇缺失影响
外源补充胆固醇对SCAP敲除细胞中胆固醇生物合成途径近端和远端酶的表达水平均无影响。SCAP敲除可部分抑制CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖，CD8+T细胞受抑制影响程度高于CD4+T细胞，外部补充胆固醇可挽救上述表型。
研究人员进一步使用洛伐他汀抑制近端酶HMGCR（抑制胆固醇和类异戊二烯的产生）或通过Ro 48-8071抑制远端酶OSC（仅抑制胆固醇的产生），两种处理对CD8+T细胞增殖的抑制程度均高于CD4+T细胞，提示CD8+T细胞比CD4+T细胞更容易受到胆固醇缺乏的影响。
图源：Cancer Cell 官网
胆固醇缺乏应激诱导CD8+T细胞自噬介导的凋亡
在明确胆固醇缺乏引起的T细胞凋亡细胞亚群后，研究人员证实胆固醇或凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)可挽救Ro 48-8071诱导的CD8+T细胞凋亡。在胆固醇缺乏的CD8+T细胞中观察到明显的自噬信号——ULK1磷酸化降低和LC3b成熟，证实胆固醇缺乏应激诱导CD8+T细胞自噬介导的凋亡。此外，与CD4+T细胞相比，CD8+T细胞在抑制胆固醇生物合成后成熟LC3b表达水平更高，提示自噬可能是CD8+T细胞对胆固醇缺乏应激高易感性的机制。
图源：Cancer Cell 官网
衰竭T细胞中SREBP2和LXR通路转换
细胞胆固醇代谢主要受两个关键转录因子调控，胆固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）和肝X受体（LXR）。SREBP2转录胆固醇生物合成和摄取基因上调细胞胆固醇水平，而LXR转录胆固醇外排和抑制胆固醇摄取基因下调细胞胆固醇水平。研究人员在肿瘤微环境内凋亡CAR-T细胞中验证了SREBP2通路下调，LXR通路上调，从而抑制胆固醇的获取并增强胆固醇的外排。通过分析HCC模型RNA测序数据，同样支持在T细胞衰竭或T细胞功能障碍过程中，SREBP2和LXR通路转换结论。此外，体外肝癌Huh7细胞重复挑战CAR-T细胞会引起类似的SREBP2/LXR通路转换， Huh7细胞条件培养基诱导SREBP2通路抑制和LXR通路激活。
图源：Cancer Cell 官网
慢性T细胞受体TCR刺激并未激活LXR，反而抑制LXR途径，表明肿瘤分泌因子或慢性抗原刺激均可改变SREBP2和LXR两条胆固醇代谢途径，但肿瘤微环境中在引起T细胞胆固醇缺乏的过程中发挥更为重要的作用。
进一步，在靶向肝癌细胞的GPC3 CAR-T治疗系统中，研究人员证实肝癌细胞条件培养基和肝癌患者样本中富集多种胆固醇代谢物，其中包括氧化型胆固醇，特别是27-羟化胆固醇（27-HC）。氧化型胆固醇通过抑制SREBP2通路并激活LXR通路来导致T细胞胆固醇缺陷是肿瘤微环境浸润T细胞胆固醇缺乏的原因。
图源：Cancer Cell 官网
SREBP2/LXR途径异常驱动T细胞衰竭或T细胞功能障碍
研究人员通过RNAseq进一步探索了SREBP2/LXR途径转换如何影响T细胞衰竭或T细胞衰竭功能障碍。RNAseq分析结果揭示了胆固醇缺乏细胞胆固醇缺乏特征基因集中含有多个重要的信号通路和代谢通路，表明胆固醇缺乏可影响多种重要的信号和代谢通路来影响T细胞增殖与存活，从而引发肿瘤微环境中T细胞耗竭或失能。
图源：Cancer Cell 官网
肝癌模型中，LXRb敲除促进CAR-T细胞肿瘤杀伤活性
鉴于CAR-T细胞中SREBP2/LXR通路转换，抑制LXR途径或促进SREBP2途径是较好的CAR-T细胞胆固醇正常化策略。考虑到前述结果中，T细胞耗竭时LXR调控基因发生了显著改变，研究人员随后测评了基于LXR抑制策略影响CAR-T细胞肿瘤杀伤活性。
LXR有两种亚型，限制性表达的LXRa和常规性表达的LXRb。研究人员发现，仅LXRb-KO的CAR-T促进CAR-T细胞肿瘤杀伤活性。在转录水平上，LXRb敲除导致lxr转录基因明显下调，而SREBP2转录基因变化较小。LXRb基因敲除可显著抵抗LXR激活引发的T细胞胆固醇缺乏并增强GPC3.BBZ CAR-T细胞的体内抗肿瘤能力。
图源：Cancer Cell 官网
综上所述，本研究首次绘制了肿瘤微环境内细胞胆固醇全景图，并阐明了T细胞胆固醇缺乏的机制及其胆固醇缺乏对T细胞功能的影响。靶向和调节胆固醇代谢有望提高工程化CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。
本研究通讯作者为中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所/中国科学院分子细胞科学卓越中心许琛琦及武汉大学宋保亮。
参考文献
- Chengsong Yan, Lin Zheng, Shutan Jiang, et al. Exhaustion-associated cholesterol deficiency dampens the cytotoxic arm of antitumor immunity. Cancer Cell (2023). https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.04.016.