防己黄芪汤治疗类风湿性关节炎的关键靶点和生物活性成分被揭示

防己黄芪汤治疗类风湿性关节炎的关键靶点和生物活性成分被揭示

类风湿性关节炎（RA）是一种严重的自身免疫性疾病，目前中医药在治疗RA方面积累了丰富的经验。近期，南方医科大学中医药学院朱全红团队在《民族药理学杂志》发表重要研究成果，揭示了传统中药方剂防己黄芪汤（FHD）治疗RA的关键作用机制。研究发现，粉防己碱是FHD中的关键活性成分，通过抑制COX-2发挥抗炎作用。

类风湿性关节炎（RA）是一种严重的异质性自身免疫性疾病，防己黄芪汤（Fangji Huangqi Decoction，FHD）是一种用于治疗RA的经典中药复方，由4种草药（防己、黄芪、白术、甘草）组成，效果令人满意。FHD以其补气强外、祛风祛湿的能力而闻名，但其治疗RA的机制和生物活性化合物仍不清楚。

2024年8月31日，南方医科大学中医药学院朱全红团队在Journal of Ethnopharmacology发表了题为“Screening bioactive compounds from Fangji Huangqi Decoction for treating rheumatoid arthritis via COX-2 magnetic ligand fishing combined with in vivo validation”的文章，研究了防己黄芪汤改善类风湿性关节炎的关键靶点和生物活性化合物，发现环氧合酶2（COX-2）是FHD改善RA的关键靶点，粉防己碱（Tetrandrine）负责FHD对RA作用的主要生物活性成分。机制上，粉防己碱与COX-2的Tyr385残基结合，抑制COX-2蛋白表达和抑制COX-2的酶催化活性，减少前列腺素和炎性代谢物的产生，发挥抗RA作用。此外，FHD的作用优于汉防己甲素，表明FHD还含有其他化合物在FHD治疗RA时发挥作用，这体现了中医方剂治疗疾病的“多组分”特征。

1、COX-2蛋白是FHD治疗RA的关键靶点
作者首先通过网络药理学分析预测FHD改善RA的关键靶标，其中PTGS2为最核心靶点，COX-2是PTGS2基因编码的蛋白酶，可能是FHD改善RA的关键靶标，且已有报道表明COX-2是抗关节炎靶点，可以调节前列腺素的产生来抑制炎症。因此作者研究了FHD中作用于COX-2的生物活性成分（图1）。

2、通过COX-2@MBs对FHD进行配体捕捞和分析
为了控制FHD提取液的质量，作者获得FHD提取液，质谱鉴定到23个特征峰，其中7个通过标准品确定为粉防己碱、防己诺林碱等。接着作者制备了cox-2固定化磁珠（COX-2@MBs），将其与FHD溶液共孵育，并用UPLC-MS分析洗脱液，鉴定出11种成分，其中7个在洗脱液中含量较高，通过标准品鉴定为粉防己碱、汉防己丙素、防己诺林碱、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草查尔酮B（图2、图3）。

3、体外筛选对COX-2酶活性有良好抑制作用的成分
利用商品化COX-2抑制剂筛选试剂盒，测定了7种含量较高的成分的IC50值，其中粉防己碱、汉防己丙素、防己诺林碱、甘草查尔酮BIC50值均小于200μM，防己诺林碱的IC50值最低，为17.25±1.16μM，表明这4种成分对COX-2酶活性有较强的抑制作用，是FHD中通过抑制COX-2治疗RA的潜在生物活性成分，但其抑制活性并不优于塞来昔布（celecoxib，对COX-2具有选择性抑制作用，已被用于治疗RA的一线药物，通过抑制COX-2酶活性来抑制前列腺素的产生，从而有效缓解RA患者的炎症症状）。

4、体内筛选对急性关节炎症有抑制作用的成分
角叉菜胶诱导的急性水肿模型大鼠通常用于评价潜在的COX-2选择性抑制剂如塞来昔布对急性炎症的抑制作用，作者发现虽然这7种成分均能特异性地与COX-2结合，但只有粉防己碱一种成分不仅能抑制COX-2酶活性，还能抑制急性炎症（图4）。

5、粉防己碱作为FHD的主要生物活性成分通过COX-2抑制胶原诱导性关节炎
心脏组织H&E染色结果显示粉防己碱不会引起CIA小鼠的心脏毒性（图5）。粉防己碱可减轻CIA小鼠的爪水肿，显著减轻关节炎症，改善CIA小鼠的爪子和关节骨质量，降低CIA小鼠踝关节COX-2水平。FHD显著改善了CIA小鼠的症状，降低CIA小鼠踝关节COX-2水平，表明COX-2是FHD治疗RA的关键作用靶点。

值得注意的是，FHD组与中、高剂量粉防己碱组的AI评分及血清IL-6水平差异均无统计学意义，但低剂量粉防己碱组的这两项指标显著低于FHD组。结果表明，虽然FHD煎剂（1.55μg/mL）中粉防己碱的含量约为低剂量粉防己碱溶液（1.25 mg/mL）中粉防己碱的0.1%，但FHD对胶原诱导的足部水肿和血清IL-6表达的抑制作用优于低剂量粉防己碱。

此外，体外COX-2酶活性测定和体内角叉菜胶诱导的急性炎症试验结果表明，单独使用其他捕获组分的生物活性作用远弱于同剂量粉防己碱。结果表明，FHD中除了主要活性化合物粉防己碱外，还存在其他活性成分，可能与粉防己碱发挥协同作用，抑制RA，体现了中药方剂治病“多成分”特点（图5、图6、图7）。

6、粉防己碱与COX-2蛋白结合方式的分子对接
最后，作者通过计算机模拟优化COX-2蛋白和粉防己碱的三维结构，研究了配体粉防己碱与受体COX-2的空间拟合度和能量匹配度，确定了它们的结合亲和力和结合模型。结合能为-7.35kcal/mol，粉防己碱与COX-2残基Thr212之间形成氢键。此外，粉防己碱与COX-2的残基Tyr385结合，该位点被报道是COX-2将花生四烯酸（AA）转化为前列腺素E2（PGE2）的酶催化位点之一。因此，作者推断粉防己碱竞争性地占据了AA在COX-2蛋白上的结合位点，从而减少前列腺素和炎性代谢物的产生，最终实现其抗类风湿关节炎作用（图8）。

总结
研究使用网络药理学发现COX-2是FHD改善RA的关键靶点，利用COX-2固定化磁珠的配体垂钓技术来识别作用于COX-2的生物活性成分，接着进行了COX-2酶抑制的体外测定和角叉菜胶诱导的炎症和胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）的体内测定，以验证这些捕获成分的生物活性作用。在CIA分析中，采用显微CT、苏木精\伊红染色和番红-O/快速绿染色分别评估捕获的配体对骨损伤、病理损伤和软骨破坏的影响。免疫组化和酶联免疫吸附试验检测踝关节中COX-2靶标的表达，ELISA检测血清中IL-6水平，分子对接用于揭示COX-2蛋白与捕获的配体的结合机制。结果显示，tetrandrine是负责FHD对RA作用的主要生物活性成分，通过抑制COX-2蛋白的表达和抑制COX-2的酶催化活性，减少前列腺素和炎性代谢物的产生，发挥抗RA作用。

通过配体垂钓技术从临床治疗类风湿性关节炎的复方方剂防己黄芪汤中发现粉防己碱是COX-2的特异性配体。通过胶原诱导的关节炎小鼠体内证实粉防己碱是FHD的生物活性成分，通过靶点COX-2缓解RA症状。