细胞消化与传代：方法、步骤及注意事项

细胞消化与传代：方法、步骤及注意事项

细胞消化与传代是生物医学研究中的基础实验技术。本文将详细介绍细胞消化的各种方法，并以贴壁细胞系为例，提供具体的消化、分离、计数和传代步骤，帮助研究人员更好地掌握这一实验技能。

细胞消化方法通常可分为机械消化法、离子螯合法和酶消化法，这些方法用于将细胞结构破坏以获取细胞内的物质。在考虑细胞损伤和继续培养的情况下，胰酶消化法是最常用的方法。胰酶消化法能够有效地降解细胞表面的连接蛋白和基质质量，从而使细胞能够轻松地从培养基表面脱离。

然而，对于悬浮细胞的传代过程来说，相对而言机械消化法更为简单，无需使用酶类。因此，以贴壁细胞系为例，我们通常会选择酶消化法来进行细胞的处理。这种方法通过添加适量的胰酶等酶类来分解细胞表面的连接物质，使细胞能够以悬浮状态存在于培养基中。

细胞消化方法的选择取决于具体的实验目的和细胞类型。无论采用哪种方法，都需要细心操作以最大程度地保护细胞的完整性和生物活性，从而确保后续实验的准确性和可重复性。

细胞消化

当细胞生长到密度接近80% 时，需要进行消化传代。

1. 弃去旧培养基，用预热好不含钙离子、镁离子的PBS润洗两次，以去除旧培养基对胰蛋白酶消化的抑制作用。
2. 加入适量的胰蛋白酶，放入培养箱中消化，根据不同细胞种类的不同消化时间，在显微镜下观察到细胞形态变圆脱落、细胞间隙变大、瓶底呈现花斑状时，用两倍于胰蛋白酶的完全培养基终止消化。

细胞分离

细胞消化后，九宫格法吹落细胞收集到离心管，以800-1000rpm，室温离心5min。弃去胰蛋白酶，用完全培养基充分重悬细胞。

细胞计数

使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数，计算传代所需的细胞数量；或根据经验按照比例传代。

细胞传代

将培养瓶中加入部分完全培养基，而后取适量单细胞悬液加入混匀。

细胞培养

接种好细胞后，应在培养瓶上标记上细胞名称、传代日期和操作人姓名等信息，轻轻摇匀后转移到37℃、5% CO2培养箱中培养，并定期观测细胞状态。

注意事项

1. 细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
2. 在细胞消化时，应根据不同类型的细胞和不同实验目的选择适当的消化方法、消化液和消化时间。例如在使用流式细胞仪检测细胞凋亡等试验时，需要使用不含EDTA的弱消化液，以防止过度消化损伤细胞造成的细胞死亡影响实验结果。

• 比较难消化的细胞，可以分批次消化 ，减少过度吹打损伤细胞，避免先消化下来的细胞被过度消化。
• 比较容易消化的细胞可以选择浓度低的胰蛋白酶（一般采用的浓度为 0.1%-0.25%）或者用PBS稀释胰酶使用。

3. 传代密度需要根据不同特点的细胞分别考虑，有些细胞有密度依赖，密度低导致的不增殖、细胞老化；同时也有密度高导致生长抑制或非单层生长导致不好消化的情况。
4. 注意温度、PH、血清、钙、镁离子等因素对胰酶的抑制作用。