色谱基础知识：从原理到应用的全面解析

色谱基础知识：从原理到应用的全面解析

色谱法是一种利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域的物质分析。本文将系统介绍色谱法的基础知识，包括其起源、定义、分类、优点以及HPLC的具体分类和应用。

第一部分 色谱基础知识

1. 色谱起源

色谱法最早可以追溯到1906年，俄国植物学家米哈伊尔·茨维特（Mikhail Tsvet）在研究植物色素时，首次使用了色谱技术。他将植物色素溶解在酒精中，然后通过碳酸钙柱进行分离，得到了不同颜色的色素带，这就是最早的色谱分离实验。

2. 色谱定义

色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术
流动相：携带样品流过整个系统的流体
固定相：静止不动的一相，色谱柱

3. 色谱分类

1. 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2. 气相色谱 Gas Chromatography (GC)
3. 薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)
4. 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)

4. 色谱优点

1. 同时分析
2. 分离性能好
3. 灵敏度高 (ppm-ppb)
4. 进样量小 (1-100uL)

HPLC vs GC

• 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
• 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析
• 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
• 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
• 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析
• 流动相只起运载样品分子的能力

5. HPLC分类

1. 正相模式 (NP-LC)
2. 反相模式 (RP-LC)
3. 反相离子对色谱 (IPC)
4. 离子交换色谱 (IEC)
5. 尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)

反相模式 (RP)

填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基
相互作用力：
反相模式下流动相的选择：
优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要（甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂）
在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要
增加流动相极性：
固定相极性变化对分离的影响：

离子对色谱

离子对试剂

• 阴离子化合物：氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵
• 阳离子化合物：丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6）、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)
  离子对色谱影响因素
• 离子对试剂的类型
• 离子对试剂的浓度
• 流动相的pH

正相色谱

色谱柱：

• 硅胶柱:常用
• 氰基柱: 常用
• 氨基柱: 分析糖
• 二醇基柱: 分析蛋白质
  相互作用力
  氢键力
• 如果样品有
  -- -COOH: 羧基
  -- -NH2: 氨基
  -- -OH: 羟基
  则氢键力强.
• 如果样品没有任何官能团，象碳水化合物
• 如果样品有大的基团, 由于空间障碍
  则氢键力弱.
  正相模式下流动相的选择：
• 主要试剂：烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳
• 辅助试剂：甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇
  为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。
  增加流动相极性：

反相色谱与正相色谱的对比：

反相：保留时间重复性好、固定相耐用
正相：对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等)、保留时间重复性稍差
离子交换色谱：
离子交换色谱应用：
生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析)
离子分析
阳离子交换剂：强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)
弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-)
阴离子交换剂：强阴离子交换剂(SAX) (R4N+)
弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)

尺寸排阻色谱法（SEC）

第二部分 柱子基本性能参数

1. 表征色谱柱的参数

硅胶纯度：填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度。
色谱柱尺寸：填料床的长度和内径。
颗粒形状：球型或不规则型。
粒径：平均颗粒直径,通常3-10μm。
表面积：颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示。
孔径：颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å。
碳百分率：与基体物质相连的键合相的量。
封尾：用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来。

2. 表征色谱柱性能的参数

（1）容量因子, k'
（2）理论塔板数, N
（3）分离度, Resolution
完全分离时的分离度
（4）拖尾因子，T

第三部分 HPLC硬件基础知识

1. 液相色谱简易流程图

2. 流动相的选择

（1）采用“HPLC”级溶剂
（2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂
（3）对试样有适宜的溶解度
（4）溶剂粘度要小
（5）与检测器相匹配
水的等级
HPLC用水可以通过以下几个方法得到：
（1）专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。
（2）去离子水重蒸；
（3）二次或三次重蒸水；
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。
有机溶剂的等级
应选用HPLC级的有机溶剂。
缓冲盐
选择缓冲液的步骤：

1. 确定最佳分离状态时的流动相pH
2. 选择具有与流动相pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）
3. 确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）
   
   缓冲液的使用：
   （1）使用前必须过滤。
   （2）使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇 的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min。
   （3）用纯水冲洗泵头清洗管路。
   （4）易受到细菌和霉菌的影响。
   流动相的更换
   不互溶的流动相不能直接更换，缓冲盐不能直接用有机溶剂更换
   溶剂的黏度
   （1）乙腈黏度低在相同流速时有较低的柱压。
   （2）当和水混合时黏度有变化柱压也相应有变化。
   溶剂前处理

过滤

过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。

滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。

脱气

脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡
气泡对测定的影响：
（1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
（2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
（3）检测器中的气泡产生基线波动
脱气方法：

1. 超声脱气
2. 减压脱气
3. 在线脱气

3. 样品前处理

（1）使用流动相溶解样品
--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要
--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中，
尤其在柱中产生沉淀
（2）进样前最好使用0.45um 的滤膜进行过滤，
如果样品很脏，要使用0.22um的滤膜进行过滤。
（3）对于含有复杂基质的样品，最好前处理后再进样。

4. 进样

（1）进样器

• 自动进样器
• 手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入
  （2）手动进样器的原理图
• 部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20μl的定量环最多进样10μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同。
• 全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。

5. 洗脱

（1）等度洗脱
（2）梯度洗脱
使用梯度洗脱的原因：
梯度洗脱要点：
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度
注意事项：
（1）溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差。
（2）梯度混合的溶剂互溶性要好。
（3）梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如
紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变
化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。
（4）查看空白实验的数据。
（5）遵守分析周期（最初的分析数据不采用）。

6. 色谱柱的类型及适用范围

7. 分析柱的维护

1. 在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗30 min，长时间未用的分析柱也要同样处理。
2. 定期使用强溶剂冲洗柱子。
3. 使用缓冲盐时，要先用含5%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。
4. 净化样品。
5. 分离条件。
6. 不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸。

8. 常用检测器

（1）紫外检测器（包括二极管阵列检测器）
（2）荧光检测器
（3）示差折光检测器
（4）电导检测器
（5）蒸发光散射检测器
（6）质谱检测器