关于『自噬』，你了解多少？
关于『自噬』，你了解多少？
自噬是细胞在应对压力和维持稳态时的重要机制，它通过降解细胞内的蛋白质和细胞器来实现物质的循环利用。这一过程不仅对细胞的生存至关重要，还与多种疾病的发生发展密切相关。本文将带你深入了解这一神奇的细胞自我保护机制。
自噬（autophagy=self-eating）意为自体吞噬，是真核细胞在自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程。自噬可防止细胞损伤，促进细胞在营养缺乏的情况下存活，并对细胞毒性刺激作出反应。虽然自噬在饥饿和/或应激条件下发挥细胞保护作用，但其还可调节代谢条件，在不同程度上导致各种人类疾病。研究表明，自噬与癌症及系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生发展有关。
根据胞内物质运送到溶酶体方式的不同可将自噬分为：
① 巨自噬（macroautophagy）：待降解物由双层膜包裹形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物；
② 微自噬（microautophagy）：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解；
③ 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。
图1. 3种自噬途径
(Duraes Fernanda V et al. Front Immunol, 2015)
自噬通常指巨自噬，诸如饥饿等多种因素均可诱导自噬发生，细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个由细胞器膜或质膜等构成的碗状双层膜结构，被称为隔离膜(phagophore)；隔离膜不断延伸，将细胞质中的细胞器、蛋白质等包裹起来形成封闭的球状体，即自噬小体(autophagosome)；自噬体通过酸化与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome)，降解其所包裹的内容物。
图2. 自噬过程
(Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010)
自噬的调控
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反应中起着重要的调节作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反应被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）被抑制后，自噬反应机制启动。自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）通过形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)复合物来调控自噬体的形成。
自噬既能抑制也能促进细胞凋亡，两种反应在生物体内广泛存在。在营养缺乏时，自噬反应作为一个细胞的促活反应机制存在，但是过量的自噬反应也会导致细胞死亡，但由自噬导致的细胞死亡与细胞凋亡在形态学上有明显的不同。几种促凋亡信号因子，如TNF, TRAIL, and FADD也会诱导自噬的反应发生。此外，Bcl-2也是自噬反应重要的调节因子，其为凋亡抑制蛋白，通过与Beclin-1结合形成复合物，来抑制由Beclin-1诱导的细胞自噬。
细胞基础水平的自噬活性很低，不适于观察，因此，对自噬研究多需人工干预。已报道的部分干预药物详见表1：
自噬检测方法
细胞经自噬诱导或抑制后，常用的观察和检测方法有：
1、透射电镜法
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接观察自噬体则需在透射电镜下。自噬各阶段的特征见表2；透射电镜下自噬小体和自噬溶酶体的形态见图2。
图3. 透射电镜下自噬小体和自噬溶酶体形态
(Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010)
2、荧光显微镜观察法
LC3（light chain 3）全称MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上。
哺乳动物中的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。
图4. LC3在自噬发生中的路径
(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出GFP-LC3单荧光指示体系和mCherry-GFP-LC3双荧光指示体系。GFP荧光蛋白是酸敏感型蛋白，而mCherry是稳定的荧光表达基团。自噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点，通过计数来评价自噬活性的的高低。当自噬溶酶体形成后，酸性的溶酶体环境使GFP荧光淬灭，mCherry荧光不受影响，自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，可通过GFP与mCherry的亮点比例来评价自噬流进程。
图5. 利用双荧光LC3B示踪自噬的不同阶段
(Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011)
3、Western Blot检测法
① 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为LC3-II。LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
② 利用Western Blot检测p62蛋白也可以用来评价自噬以及自噬流的强弱。p62是众所周知的自噬蛋白，也称为SQSTM1蛋白，由以下三个域组成：N端Phox和Bem1 (PB1)结构域、锌指结构域和C端泛素相关(UBA)结构域。研究表明p62蛋白锌指结构域和UBA结构域之间的连接区域（LRS区域）负责与自噬受体蛋白 Atg8/LC3结合，UBA结构域负责招募泛素化蛋白。自噬小体形成过程中p62作为链接LC3 和聚泛素化蛋白之间的桥梁，通过泛素信号途径将聚合的蛋白、受损的线粒体以及入侵的细菌作为受体转运到自噬小体中并将其降解。