外泌体研究保姆级攻略 |一文带你解锁外泌体最新科研思路

外泌体研究保姆级攻略 |一文带你解锁外泌体最新科研思路

外泌体是直径为 30-150 nm 的细胞外小囊泡，封装了多种功能性生物分子，包括蛋白质、RNA、DNA、脂质和代谢物。外泌体起源于多泡体 （MVB），以经典的外泌体标志物为特征，如 CD9、CD81 和 CD63。外泌体的生物发生和分泌涉及一个多步骤过程，首先涉及在细胞膜的特定区域形成凹陷，随后包裹细胞外物质或细胞膜本身的成分以形成早期内体。然后，这些早期内体经历一系列生化和形态变化，进化成晚期内体或多泡体。在 MVB 的形成过程中，晚期内体的内膜向囊泡内部突出，形成多个腔内囊泡 （ILV）。这个关键步骤主要受转运所需的内体分选复合物 （ESCRT） 介导的机制的调节，该机制负责将蛋白质、脂质和 RNA 等分子分选成 ILV，最终成为外泌体的主体。最后一个关键的阶段是细胞分泌外泌体，它决定了外泌体释放的效率。
外泌体分泌的主要机制是通过 MVB 与质膜融合，然后通过胞质溶化进行细胞外转运来实现的（图 1）。然而，MVB 也可能通过替代途径转运到溶酶体进行降解。分泌时，外泌体通过循环与邻近或远处的细胞相互作用，促进外泌体转移以调节靶细胞中的基因表达和信号通路。

图1. 外泌体形成和生物学作用 (源自[1])

在外泌体研究过程中，高纯度的外泌体，是开展实验研究的前提，如果外泌体浓度不够、纯度不高、杂质较多，会对下游的实验造成影响，如电镜下拍摄观察不到标准的外泌体结构、污染物质多，NTA检测粒径浓度太低，蛋白组学分析蛋白鉴定量不够，外泌体功能性评价时剂量达不到要求都会让我们的实验工作“夭折”，所以外泌体提取完成之后，必须做严格的质控才可以进行下游实验。
♦纯度与得率：外泌体在生物样本中的含量通常较低，且易受其他细胞成分和杂质的干扰。因此，通过提取步骤可以获得相对纯净的外泌体，提高后续实验的准确性和可靠性。不同的提取方法会影响外泌体的纯度和得率。例如，超速离心法虽然操作复杂，但可以获得高纯度的外泌体；而沉淀法则操作简便，但纯度可能较低。因此，需要根据实验需求选择合适的提取方法。
♦鉴定外泌体的存在：提取后的外泌体需要进行鉴定，以确认其存在并验证提取方法的可靠性。通过透射电镜观察外泌体的形态和结构，以及利用纳米颗粒跟踪分析技术测量外泌体的粒径和浓度，可以直观地展示外泌体的存在。
♦分析外泌体的特性：外泌体具有特定的生物标志物，如CD9、CD63、CD81、TSG101等。通过WB等鉴定方法，可以检测这些标志物的表达情况，从而了解外泌体的特性和来源。外泌体中的蛋白质、核酸等生物活性分子也具有重要的研究价值。通过提取鉴定，可以进一步分析这些分子的组成和功能，为深入研究外泌体的生物学作用提供基础。
图2.外泌体鉴定

（1）外泌体生物标志物筛选相关文章及方法

前期收集了肺癌（LC） 或非肺癌（NC）患者的唾液，并通过超速离心成功分离了唾液外泌体。对 NC 和 LC 组的外泌体样品进行 miRNA 测序，采用 dgeR 测定差异表达 miRNAs （DE miRNA），采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）验证 3 种差异表达 microRNAs （miRNAs）。根据测序结果共鉴定出 372 个 miRNA。随后，在 LC 与 NC 中鉴定出 15 个 DE miRNA，包括8个上调的miRNA 和 7 个下调的 miRNA。一些 DE miRNAs 通过 qPCR 进行验证。共发现488个上调的 DE miRNAs 的靶基因，功能分析表明许多靶基因在与癌症相关的通路中富集。这表明唾液外泌体的 miRNA 可能具有用作预测和诊断肺癌的生物标志物的潜力[2]。
外泌体生物标志物研究思路:外泌体作为液体活检的新靶点。外泌体富集于体液中，在肿瘤发生、进展和转移过程中起着关键作用。与CTC和ctDNA相比，外泌体具有许多优越的特性，如活细胞分泌的囊泡、大量且稳定的循环。传统和先进的技术已被用于从各种体液中分离外泌体并检测其所载的分子。对外泌体中特定分子的检测可能为癌症诊断、进展监测和预后预测提供一种新的策略。
（1）首先根据研究的内容确定检验需求；
（2）建立临床队列，根据疾病的分类、分期、转移情况、疗效、预后等情况对患者进行分组。
（3）收集临床标本（血液、尿液、唾液等）；
（4）分离外泌体，并随机挑选几份外泌体进行电镜、粒径以及WB检测，确认外泌体纯度没有问题后，进行高通量测序或蛋白质谱；
（5）多组学联合分析，寻找差异biomaker；
（6）进行qRT或WB验证；
（7）临床样本验证及分析；
（8）科研成果产出（文章、专利、试剂盒）。
图3. 生物标志物筛选流程图

（2）植物外泌体研究思路流程
♦客户本身研究中药或者植物相关方向：如果前期有实验证明某种植物材料有效果（抗炎、抗癌、抗衰老……），外泌体作为细胞功能通讯的信使，有可能在其中发挥着重要的作用，可以开展一些细胞功能试验进行验证，如果证实有效果，后续可以构建动物模型，展开相应的动物实验。
图4. 外泌体细胞和动物类的相关实验
♦如果没有具体研究方向，可以先查阅文章确认外泌体是否有某种治疗疾病的效果，前期可以先进行外泌体提取、鉴定+miRNA测序, miRNA 测序分组应该为：对照组-植物组织，实验组-植物组织外泌体；实验简单、周期短，成本低，省心。通过对测序结果分析后，寻找相应的通路，反向推该植物是否能具有调控某种疾病的功能，也可以考虑从跨界调控的角度去分析。
该研究比较了两种方法从蓝莓中提取外泌体样纳米粒子（B-ELNs），并通过高通量测序分析了其miRNA谱，揭示了其潜在的跨界调控人类基因靶点。采用尺寸排阻色谱法与传统超速离心法对比提取蓝莓来源的外泌体样纳米粒子，并利用高通量测序技术分析其miRNA组成。通过尺寸排阻色谱法成功提取了B-ELNs，并发现36种miRNA在B-ELNs中富集，主要属于miR166家族和miR396家族；实验使用的数据集为蓝莓组织与B-ELNs的miRNA对比数据，结果显示B-ELNs可能调节与人类消化系统、免疫系统及传染性疾病相关的通路。
图5. 通过超速离心和尺寸排阻从蓝莓中分离的 B-ELN示意图（源自[3]）

（3）动物外泌体研究思路流程
外泌体内部包裹着大量非编码RNA(miRNA、lncRNA等)，可以对它们进行研究：
♦通过不同品种动物（例如水牛与牦牛，黑猪与白猪），同一部位的组织中外泌体内容成分的研究（转录组学、蛋白组学、代谢组学等），探究他们产生不同味道和肥瘦的原因，为什么有的品种瘦肉多，有的肥肉多，有的吃起来没有腥味。
♦通过对雌（母）动物的乳腺相关外泌体进行研究，了解该种动物产仔后的生存率相关性，母乳中营养成分（小分子）向子代传递后对子代免疫、抗病和生长增重的有利作用。
♦通过对同一物种，来自不同部位的组织外泌体进行研究，找到共有的小分子，比如某miRNA在多部位都有富集，查找数据库知道这个miRNA对某种基因或者某个通路的调控作用，可以开展后续的抗病机理研究。
作者从一个养鸭场的鸭子中收集病菌材料，然后分离和纯化一种名为鸭疫里默氏杆菌，采用浓缩和超高速离心提取SX-1外膜囊泡，通过对该囊泡进行鉴定后，电镜检测囊泡结构，粒度分析揭示了颗粒的大小和丰度，接着采用无标记蛋白质组学技术鉴定外膜囊泡中的蛋白质。ATCC 11845 作为参考基因组序列，采用蛋白质组学分析鉴定出 148个蛋白质，根据其来源分为 5 类。其中，24 个来源于细胞质蛋白，4个来源于细胞外分泌蛋白，27 个来源于外膜蛋白，10 个来源于周质蛋白，83 个来源不明。通过对 OMVs 进行了蛋白质组学分析，为开发 鸭疫里默氏杆菌 OMVs 疫苗和佐剂提供理论依据，为进一步研究鸭疫里默氏杆菌致病性与 OMVs 之间的关系奠定了基础。

4、外泌体未来发展前景
当前全球人口老龄化加剧，人类对精准医疗、高效治疗的需求不断增加，外泌体作为一种具有独特生物活性和功能的纳米粒子，在生物医学研究、医学诊断、药物递送和疾病治疗以及化妆品等多个领域都展现出了广阔的发展前景。随着外泌体提取、纯化、鉴定等技术的不断进步和临床应用的不断推进，政府和科研机构对生物医学研究的重视程度不断提高，为外泌体行业的发展提供了良好的政策环境，外泌体有望在这些领域中发挥更加重要的作用，为人类健康和美容事业做出更大的贡献。