酚/氯仿抽提DNA原理与步骤

酚/氯仿抽提DNA原理与步骤

酚/氯仿抽提法是分子生物学中常用的DNA提取方法，其原理是利用有机溶剂使杂质蛋白变性，从而将DNA与杂质蛋白分离。本文将详细介绍酚/氯仿抽提DNA的原理、步骤及注意事项。

一、酚/氯仿抽提原理与各试剂的作用

基本原理：有机溶剂会使杂质蛋白变性，并将杂质蛋白留在有机溶剂层，而DNA分子是有水溶性的，所以会进入水溶液层，这样DNA和杂质蛋白就被分开了。

苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

氯仿：有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。

异戊醇：在酚氯仿中加入少量异戊醇，可以减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

二、酚/氯仿抽提DNA步骤

1. 向样品中加入等体积的DNA提取液（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），颠倒充分混匀；
2. 室温16000×g离心5min，使水相和有机相充分分离，小心吸出上层水相并将该层转移至新试管中。确保移液过程中不携带任何有机相；
3. 向“2”的水相中加入1/10体积NaAc (3M, pH=5.2)，涡旋混匀；
4. 加入2倍体积预冷的无水乙醇, 轻柔地颠倒混匀, 此时可以看到白色絮状物, 置于20℃冰箱中30min, 时间充裕时通常过夜冷冻析出；
5. 13200 rpm, 5 min离心, 注意观察有无白色沉淀, 吸走上清；
6. 加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
7. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
8. 加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

三、注意事项

1. 苯酚-氯仿是除蛋白的，所以要充分震荡混匀使蛋白变性，但又不能太剧烈而打断DNA；
2. 离心后要避免再次吸入有机相的苯酚-氯仿，尽量只取上清。如果吸取的上清中混杂了蛋白质层和有机相，需要用DNA提取液再次抽提；
3. 提取的DNA如果需要进行测序，或避免离子干扰的实验，建议使用蒸馏水溶解DNA而非TE缓冲液。