手把手教学——CRISPR-Cas9系统：慢病毒转染

手把手教学——CRISPR-Cas9系统：慢病毒转染

CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术，旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。

实验步骤

1. 质粒构建：构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列，可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因（之前已详细描述过）。

2. 慢病毒包装质粒：准备慢病毒包装质粒，其中包括pCMV-VSV-G（携带包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（携带包装蛋白）。这两者协同作用，使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-Cas9系统到目标细胞内。

3. 细胞培养：使用适宜的培养基培养目标细胞，通常选择293T细胞，以确保细胞处于最佳的生长状态。

4. 转染试剂准备：在进行转染前，将培养基更换为适用于阳离子脂质体转染的Opti-MEM减血清培养基。同时，准备转染试剂，包括Lipofectamine 3000、助转剂P3000以及含有CRISPR-Cas9系统的质粒。

5. 转染操作：将质粒混合物与转染试剂按照试剂盒的推荐比例进行混合，随后滴加到目标细胞上。此过程中，确保混合物与细胞充分接触，有利于转染效率的提高。

6. 培养条件：将细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中，培养一定的时间，通常在48小时内。

7. 收获：收集细胞上清液，通过离心去除细胞残渣。

8. 滤膜过滤：使用0.22μm孔径的聚醚砜滤膜过滤细胞上清液，以去除残留的细胞碎片和其他杂质。

9. 慢病毒收获：得到的慢病毒上清液即为经过纯化和感染活性验证的慢病毒，可用于后续实验中对目标细胞进行感染（若病毒感染效率低，可使用试剂盒进行浓缩病毒）。

10. 慢病毒感染：将目的细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后48H，加入适量浓度的筛选药物puromycin（具体浓度通过药物筛选实验获得），24h后换液去除死细胞，继续传代维持培养。

11. 单克隆筛选

• 流式细胞术筛选：此法存在一些不足之处，其中包括重悬细胞后进行流式筛选的过程。因为这种操作可能导致细胞经历多次振荡，增加了细胞的脆弱性，细胞的生存状况可能会受到不良影响，所以不太建议采用这种方式。

• 无限稀释法，将96个细胞稀释至10ml培养基中，然后将其种植到96孔板中，确保每个孔内只有一个细胞。完成种植后，建议在观察过程中每次仅观察十个孔，因为长时间的外部观察可能导致细胞受到应激损伤，影响后续的细胞培养，甚至会导致部分细胞死亡

进行单克隆细胞培养时，首先将细胞铺在96孔板中，培养至细胞长至80%的融合后进行消化。随后，将细胞传到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中，以确保单克隆的纯化。并非所有细胞都能成功生长，因此在考虑实际情况时，一般需要大约一两个月的时间才能获得理想的实验结果。

12. 验证敲除效果

• 蛋白水平验证：在细胞达到一定数量后，铺板提蛋白。使用未进行基因敲除的细胞作为对照组，进行Western blot分析。观察目标蛋白的条带是否出现消失现象，以确定敲除效果。

• DNA水平验证：依据设计的sgRNA序列，定位到该序列在基因组中的具体位置。选择该位置上下游约300bp范围，设计PCR引物。通过用枪头挑选细胞，进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切取目标条带后进行回收。接着，进行TA克隆，并将克隆产物送至测序公司进行测序。通过序列比对，可以确认基因是否成功被敲除。

注意事项

1. 病毒液应减少冻融次数，每一次冻融滴度会下降2-4，因此收毒时可进行分装以便后续使用。

2. 转染时可加polybrene （可提高病毒转染效，需优化最佳浓度(2–12 μg/ml))。

3. 转染前先调整好细胞状态，收毒不宜太早，应在转染后48h之后收毒。

4. 在进行实验时，可将培养皿中的细胞密度设置为4–5 x 10^6 cells/10 cm，若细胞分裂速率过快，可酌情减少铺板细胞数量，建议在细胞的汇合度达到50–80%时开始进行实验。