微生物测序报告中的多样性数据详细解读
微生物测序报告中的多样性数据详细解读
随着高通量测序技术的发展，科学家们能够解析巨量微生物DNA序列，从而获得丰富的微生物组数据。这些数据经过聚类、数据分析等处理后，可以得到微生物多样性分析报告。本文将详细解读微生物群落多样性的概念、分类以及各种多样性指标的计算方法和应用场景。
微生物群落多样性的概念
微生物群落多样性（Microbial Community Diversity）是指在特定环境中存在的微生物种类的数量和分布情况。它不仅包含不同种类微生物的丰度，还包括它们之间的相互关系。多样性可以从不同角度进行评价，主要分为以下几种：
α多样性(Alpha Diversity)： 这是衡量某一特定样本内部多样性的指标。常用的α多样性指标包括物种丰富度（Species Richness）、香农指数（Shannon Index）和辛普森指数（Simpson Index）。
β多样性(Beta Diversity)： 不同样本之间的多样性比较被称为β多样性。常用的β多样性指标包括Bray-Curtis距离和Jaccard指数。
γ多样性(Gamma Diversity)： 这是指在一个更大尺度、多个样本的总体多样性，通常用以评估一个较大区域的整体多样性水平。
实验流程与数据处理
下图是实验上机测序流程，提取的样本总DNA经过质检、PCR扩增、建库等步骤进行高通量测序得到测序原始数据。原始数据经过Reads拼接、tags过滤、去嵌合体等步骤得到有效数据clean data。在特定的相似度下进行聚类得到OTU/ASV，报告中通过降噪方法得到ASV表，一切后续分析都围绕ASV表来进行。根据ASV表可以继续做物种分类注释、丰度计算、多样性分析、差异分析、功能预测等。所以ASV特征表是微生物多样性分析中关键数据结果。
OTU和ASV的区别
OTU（Operational Taxonomic Units）: OTU是一种将序列通过相似度聚类的传统方式，来表示相似序列组成的种群。通常，这种聚类方法会将序列之间相似度达到97%（或其他设定的阈值）的序列分到同一个OTU。
ASV（Amplicon Sequence Variants）: ASV采用较新的降噪方法，可以精确地解析序列中的每一个核苷酸差异，简单来说就是以100%相似度进行聚类，对低质量序列进行去除和校正，这种方法可以生成“零半径OTU”，即互不相同的基于序列的变体。
测序原始数据情况
原始序列数据(raw tags)经过质控、过滤、去嵌合体，最终得到有效数据(effective tags)。再对有效数据进行UNOISE降噪处理，得到ASV特征表。数据处理过程中各步骤得到的序列进行途径统计，可以直观的反映每个样本的数据量和物种丰度。
Alpha多样性分析
Alpha多样性主要用来衡量单个样本内的菌群多样性，不涉及样本之间的比较。Alpha多样性与两个因素相关，分别是：一、丰富度(richness)，二、多样性(diversity)。
计算群落丰富度的指数
Chao1：Chao1算法用于评估样本中所含ASV数目的指数，Chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao(1984)最早提出。
ACE：用来估计群落中含有ASV数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一。
计算群落多样性的指数
Shannon：香农-威纳指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度，是用来评估样本中微生物多样性指数之一。
Simpson：辛普森多样性指数对菌群多样性评估，Simpson指数值越高，表明群落多样性越高。
测序深度指数
- Coverage：是指各样品克隆文库的覆盖率，其数值越高，则样品中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。
Beta多样性分析
Beta多样性指的是样本间多样性，Beta多样性是衡量个体间菌落构成相似度的一个指标。通过计算样本间距离可以获得beta多样性距离矩阵，Beta多样性计算主要基于OTU的群落比较方法，有欧式距离、bray curtis距离等。
物种多样性相关曲线
稀释性曲线（Rarefaction curve）：稀释曲线是从每个样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的ASV数目，以随机抽取的序列数与ASV数量来构建曲线。
丰度等级曲线(Rank abundance curve)：Rank-abundance曲线可用来解释多样性的两个方面，即物种丰度和物种均匀度。
Beta多样性分析方法
欧式距离（Euclidean distance）：欧几里得距离是空间中两点间“普通”（即直线）距离。
Bray-Curtis距离：Bray-Curtis距离是生态学中用来衡量不同样地物种组成差异的测度。
Unweighted UniFrac距离：非加权距离包含特征之间的系统发育关系的群落差异定性度量。
Weighted UniFrac距离：加权距离包含特征之间的系统发育关系的群落差异定量度量。
统计检验方法
Anosim检验：Anosim分析是一种非参数检验，用来检验组间差异是否显著大于组内差异。
Adonis检验：Adonis检验，多元方差分析，其实就是PERMANOVA，亦可称为非参数多元方差分析。
数据可视化方法
PCA分析：PCA(Principal Components Analysis)即主成分分析，首先利用线性变换，将数据变换到一个新的坐标系统中。
PCoA分析：主坐标分析 PCoA （Principal component analysis）是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或相异性。
NMDS分析：非度量多维尺度分析 NMDS 分析（Nonmetric Multidimensional Scaling）与上述 PcoA 分析类似，也是一种基于样本距离矩阵的分析方法，通过降维处理展现样本特定的距离分布。