纳抗偶联化疗药物：靶向化疗的新方向
纳抗偶联化疗药物：靶向化疗的新方向
化疗是治疗不同类型癌症的常用方法，但其主要问题是会对健康细胞或器官产生不良副作用。为了解决这一问题，研究人员将目光转向了靶向化疗。近年来，纳米抗体偶联药物（NDC）作为一种新型的靶向化疗方式，因其独特的优势而备受关注。本文将详细介绍NDC的作用机制、偶联策略以及在化疗中的应用进展。
化疗是对不同类型癌症广泛采用的治疗方式，然而，化疗的最大问题是对健康细胞或器官的不良副作用。这一问题可以通过使化疗药物靶向化来解决。抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）的研究已有数十年历史，与传统化疗相比，ADC已经展现出有希望的治疗效果。单抗的大分子量有助于改善单抗的药代动力学性质，但也会影响其组织渗透能力。随着ADC相关的缺陷被广泛报道，人们对纳米抗体（Nanobody, Nb）偶联药物（Nanobody-drug conjugate, NDC）的开发产生了浓厚的兴趣。NDC具有快速全身清除率、稳定性增强和肿瘤穿透率增加的优势。
国际学术期刊Journal of Controlled Release中曾发表题目为《Nanobodies as efficient drug-carriers:Progressand trends in chemotherapy》的文章。文中阐述了纳米抗体作为高效的药物载体，在化疗方面的进展和趋势，文中最后总结NDC或纳米递送载体（Nanobody-based drug delivery vehicles, NDv）的创造是一种超越化疗限制的具有吸引力的策略。
NDC的一般作用模式
NDC的一般作用模式如图1所示，NDC在患者体内施用，由于其靶向部分特异性，可以到达癌症部位。Nb与化学药物结合，识别目标癌症抗原。通过受体介导的内吞作用发生NDC-抗原复合物的内化，整个复合物在核内体/溶酶体中进一步加工，将随后激活的化学药物释放到细胞质中。溶酶体释放的有效载荷激活的化学药物通过干扰DNA链或抑制RNA聚合酶、拓扑异构酶或微管活性进一步抑制快速增殖的癌细胞，从而导致细胞凋亡。
图1 NDC的药物传递机制和抗癌作用模式
靶点选择
癌症生物标志物/抗原的新Nb的基准主要取决于抗原的表达水平、可及性和相关的亚细胞转运机制。表1总结了一些重要的癌症生物标志物/抗原，可用于靶向化疗药物递送。这些靶点也有可能在开发新的NDC或NDv治疗方法中发挥关键作用。
NDC偶联策略
NDC由Nb组成，Nb作为载体/载体，通过化学连接物与化学药物共价结合。为了提高NDC的效率，需要考虑的因素包括增强Nbs的特异性/亲和力、化疗药物或抗癌药物的类型、位点特异性附着策略、化疗药物的位置以及化疗药物与Nbs的比例，如图2所示。
（1）药物类型
用于制备NDC的化疗药物主要分为两类：DNA损伤剂和微管抑制剂。
（2）Linker（连接子）属性
- 高稳定性-确保在血液中保持足够长的循环时间，有效到达肿瘤部位；
- 自裂能力-一旦构建体内化到靶细胞内，连接体应具有释放与Nbs结合的化学药物的能力；
- 稳定性和疏水性-与疏水化学药物结合的疏水连接剂可以促进聚集，这可能导致肾脏快速清除或引发不必要的免疫原性反应；
- 可切割或不可切割的Linker在维持体循环中的NDC和到达目标位点后释放有效载荷方面发挥重要作用，也有助于位点特异性偶联。
（3）药物与纳米抗体的比例
Nbs的稳健性解释了它们比单克隆抗体更有可能进入靶细胞。
（4）特定位点共轭策略
Nbs的修饰主要集中在利用天然存在的氨基酸的天然化学活性。常用的化学偶联位点包括半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。近几十年来，蛋白质化学的进步使得使用新工具来实现形成均匀的NDC混合物的目标，这些工具包括赖氨酸酰胺偶联、插入半胱氨酸残基、插入非天然氨基酸和酶偶联。
图2在开发新型NDC时需要考虑的因素
NDv研究进展
NDv是一种将纳米抗体修饰到纳米药物载体上，利用纳米抗体结合特定抗原，对肿瘤细胞实现靶向治疗的策略。与NDC相比，NDv已被证明具有更大的药物装载能力；NDv也可以经过修饰以靶向特定抗原，从而降低所附药物的副作用；这种修饰可以导致疾病状态的快速根除。如上所述，通过使用化学偶联技术将Nbs附着在NDv表面来实现这种特定的靶向。在增加NDv特异性时，与使用单克隆抗体相比，Nbs的小尺寸具有一定的优势。这些好处包括增加了Nbs的稳定性和定向控制，这在抗原识别中起着至关重要的作用，如图3所示。下面列举三个NDV案例。
图3 单抗和Nb偶联到基于纳米技术的药物递送载体（NDv）的示意图
4.1 聚合物胶束
聚合物胶束（Polymeric micelles, PMs）是两亲性分子的纳米级复合物，在水溶液中自发组装成载体，可用于装载化学药物或其他抗癌药物。PMs因其对宿主有利的特性、生物相容性、增强的稳定性、溶解不溶性药物的能力以及在血管受损的病理区域增加积累而受到广泛关注。有研究证明了将抗EGFR Nb （7D12）偶联到含有化学药物胺黄酮（Amino flavone, AF）的基于InP/ ZnS量子点（Quantum dot, QD）的治疗性胶束，即QD- PLA - PEG胶束（见图4a-i），与不含Nb的胶束相比，靶向位点的积累提高了67倍。为了监测该NDv系统靶向EGFR受体的效率，将负载QD的Nb共轭胶束静脉注射到小鼠肿瘤模型中，并在处理5和24 h后记录荧光发射，见图4a-ii。观察到含有Nbs的胶束表现出增强的生物成像特性。随后，作者在动物模型中证明了载AF胶束的治疗特性。结果发现，无AF组，即PBS、空靶向胶束（Empty T）和游离AF之间无统计学差异。但观察到，有（AF-T）和没有（AF-NT）Nbs的AF胶束组肿瘤生长均有所下降，见图4a-iii。
图4 Nbs偶联的QD-PLA-PEG胶束
4.2 树枝状聚合物
树枝状聚合物（Dendrimer）是径向对称的聚合物纳米颗粒，由连续的分支单体层构成。Dendrimer的可控合成、优异的溶解度、高生物相容性、多价外表面和持久的稳定性使这些结构成为靶向癌症治疗中药物负载的绝佳候选者。Wu等人开发了一种使用树突纳米颗粒结合抗EGFR Nbs （7D12）递送四价铂（Pt）前药的新方法。如图5所示，受体介导的细胞内吞作用发生后，cNDC（clustered NDCs）的内化发生，随后，细胞内还原过程可以将前药激活为其活性形式，即Pt（II）种，导致DNA以时间依赖性的方式铂化。
图5构建cNDC@PEG靶向EGFR阳性癌细胞示意图
作者系统地证明了与单线态NDC形式相比，cNDC的抗癌效率。体外研究表明，不同NDC制剂对EGFR过表达细胞的抗增殖活性增强。在这些体内研究中观察到，与其他NDC相比，cNDC的半衰期更长。这导致与单线形式的NDC或单独使用药物相比，cNDC在肿瘤区域的积累增强。
4.3 脂质体
脂质体（Liposomes）是纳米级或更大（30纳米至几微米）的球形囊泡，其特征是水核，通常由免疫原性差的天然两亲性磷脂和胆固醇组成。它们具有的控制大小的合成以及亲水和疏水的特性，使它们成为一种很有前途的化学药物递送系统。S.Oliveira等人使用脂质体偶联EGa1 Nbs研究了受体下调的效果，该脂质体能够选择性识别EGFR癌症生物标志物的外域，见图6a-i。据观察，使用这种NDv系统，由于受体介导的内化，导致细胞表面90%以上的下调。此外，在脉冲孵育后3天内，EGa1-L介导的EGFR从细胞表面大量隔离，导致EGFR降解，见图6a-ii。然而，当使用单价形式的EGa1 Nbs时，没有观察到降解。脉冲孵育2天后，EGa1- l和EGa1 Nbs单独孵育的14C细胞中EGFR表达水平有显著差异，见图6a-iii。Meel等人报道了抗EGFR Nb （EGa1）偶联脂质体的发展，用于靶向递送抗IGF – 1R激酶抑制剂AG538。研究者观察到，这种NDv导致IGF-1R和EGFR信号的抑制，随后激活存活途径和下游细胞增殖，见图6b-i。NDv在体外模型中增强的抗癌作用鼓励随后使用体内模型进行评估。使用小鼠做实验，一组注射具有中等侵袭性的癌细胞（MB-468细胞系），另一组注射具有侵袭性生长的细胞（14C细胞系）。研究者观察到，在快速增殖的14C异种移植物中，与对照组相比，NDv显著抑制异种移植物模型。然而，在生长缓慢的MB-468异种移植物模型中，与对照组相比，NDv没有表现出任何显著的肿瘤抑制作用，见图6b-ii。
图6 使用脂质体偶联Nbs
结语
NDC或NDv的创造是一种超越化疗限制的有吸引力的策略。使用这些技术的长期目标将是通过将细胞毒素直接转运到癌细胞，大大减少副作用和与健康组织和器官的不必要的相互作用。与单克隆抗体相比，Nbs可以被认为是下一代靶向治疗的未来。单克隆抗体对更深层次抗原的识别效率较低，因此使NDC优于ADC。Nbs与位点特异性偶联化学的结合在这篇综述中被认为是NDC比ADC具有显著治疗效果的巨大潜力的证据。随着越来越多的研究小组每年都在研究基于Nb的治疗方法，很快就会看到基于Nb的药物发现的后期实际开发和转化，用于治疗不同的和基于Nb的生物传感器的诊断应用。
本文原文来自雪球App，作者：江苏耀海生物CDMO