细胞冻存与复苏避坑指南

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@小白创作中心

细胞冻存与复苏避坑指南

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来源

http://www.lbhbio.com/nd.jsp?id=24

细胞冻存与复苏是生物医学研究中常见的实验操作，其目的是为了长期保存细胞系并保持细胞的活性。然而，这一过程需要严格控制操作条件，否则可能导致细胞损伤或死亡。本文将为您详细介绍细胞冻存与复苏的基本原理、具体操作步骤以及常见问题解答。

一、为什么要慢冻快融？

冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶。如果直接将细胞冻存到-196℃的液氮中，由于冻结过程中胞外溶液中的水先结冰，使胞外溶液不断浓缩，引起细胞电解质升高、渗透压改变、脱水及蛋白质变性等，会导致细胞受到机械性损伤。

在冷冻保存时，细胞外环境中的水会结冰。冷却速度的不同会导致细胞由于渗透脱水而发生不同程度的收缩。细胞外环境的渗透压随着水结成冰晶而不断升高，冷却速度越慢，细胞内水分通过渗透作用移出胞的时间就越长。因此，非常缓慢的冷却可能会导致细胞因过度脱水而死亡(A)。而快速冷却(C)会导致细胞内形成冰晶，这会导致细胞在复温时死亡。中间冷却速度(B)则可以平衡渗透脱水和细胞内结冰形成的风险，通常可以实现细胞存活率**化。

如果在冻存液中加入保护剂(如DMS0)，可使冰点降低，增加细胞渗透压稳定性。减缓慢速降温过程中的脱水皱缩现象，在缓慢冻结时减少冰晶的生成，使细胞免受损伤。

而在复苏时，需要快速升温，在1-2min内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。

二、细胞冻存

了解了慢冻快融的原理，还有哪些Tips可以提高冻存和复苏的成功率呢？那么冻存细胞的**时机是什么时候?什么样的细胞浓度合适?要用多少冻存液呢?怎么实现细胞的“慢冻”呢?

① 时机

细胞处于对数生长期，状态良好，且实验结果良好，此时的细胞最适合冻存。在复苏后两周内冻存细胞，留一部分细胞继续培养用于后续实验。

② 冻存液

冻存液应于实验当天新鲜配制。常用的细胞冻存液配方为①培养基:血清:DMSO=7:2:1或②血清:DMSO=9:1DMS0是最常用的冷冻保护剂，5-10%的DMS0可用于大多数细胞的冷冻保存。DMSO有吸湿性，如使用DMSO作为冷冻保护剂，应将其储存于干燥环境中，避免使用开封1年以上的DMS0。冻存液中加入血清有助于解冻后的细胞恢复，但是随着无血清培养基的广泛应用，需要能够在没有血清的情况下冻存胞，不含血清的市售冻存液也是一个很好的替代选择。

③ 细胞浓度

建议细胞浓度为1x10cells/mL。根据细胞类型的不同，可扩展至5x105~1x107cells/mL。更高的细胞浓度并不会提高解冻后的活细胞数量，反而会由于高浓度引起的堆积效应而影响细胞活力。

④ 冻存液体积

常规2mL冻存管以1mL冻存体积为佳。不建议单个样本体积过大，否则会由于各部分冷却速度不一致而导致细胞活力受损。

⑤ 降温速度

对于大多数细胞,-1°C/min的降温速度能够极大保存细胞活力。可使用程序降温盒或梯度降温，推荐的梯度降温步骤为4℃20min→>-20℃30min→>-80℃过夜→液氮保存,亦可选用市售非程序性细胞冻存液,可直接存放至-80°C

⑥ 降温速度

短期可储存在-80℃,长期储存应保存在液氮中。长期存放于-80℃可能会降低细胞活力和功能。

⑦ 标记和记录

在冻存管上清楚标记细胞名称、代数、冻存人和冻存时间,并在记录本上登记细胞信息以及详细的存放位置,以便在复苏的时候正确拿取细胞。