关于『细胞自噬』，发生过程、检测方法、研究思路，看这一篇就够了！

关于『细胞自噬』，发生过程、检测方法、研究思路，看这一篇就够了！

细胞自噬是细胞内一种重要的自我保护机制，通过选择性地清除受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，维持细胞内环境的稳定。本文将从自噬的基本概念、种类、发生过程、调控机制、相关蛋白以及检测方法等多个方面，为您全面解析这一生命科学领域的热点话题。

自噬的基本知识

1. 自噬概念

自噬（autophagy）是II型程序性细胞死亡，与凋亡、铁死亡、焦亡等同属于程序性死亡。它是指细胞利用溶酶体降解，选择性地清除自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用的正常动态生命过程。自噬被认为是机体的一种自我保护机制，但过度自噬也是一种不好的行为。

2. 自噬种类

• 巨自噬（macroautophagy）：细胞的整个区域被包围在双膜小泡的自噬体中，这些自噬体然后与溶酶体融合成为自噬溶酶体，其内容物随后被其中的蛋白酶降解。一般情况下所说的自噬是指巨自噬。

• 微自噬（microautophagy）：细胞器或是内含物的囊泡直接与溶酶体相互作用并融合，微自噬比巨自噬更具特异性，可由受损细胞器表面的信号分子触发。

• 介导自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA）：也称为伴侣介导的自噬，胞质内的蛋白质通过胞质伴侣与溶酶体融合，通过分子伴侣与底物氨基酸序列内的五肽相互作用，例如底物蛋白与溶酶体LAMP-2A，并被转运到溶酶体中进行降解。

3. 自噬的发生过程

自噬的本质其实是细胞内的膜重排，其发生过程大体分为以下4个阶段：

1. 自噬的起始
2. 隔离膜和自噬体的形成
3. 自噬体与溶酶体融合
4. 自噬体的裂解

步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，有点像半球形，就像一个由2层脂双层组成的碗，会包裹住受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器。这样类似碗状的结构可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。

步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

5. 自噬的调控

细胞基础水平的自噬活性很低，不适于观察，因此对自噬研究多需人工干预。目前常用的自噬激动剂有Rapamycin和EBSS等，常用的自噬抑制剂有Chloroquine、3-MA、NH4Cl和 Bafilomycin A1等。这些自噬激动剂和抑制剂可以分别激活/抑制自噬发生的不同阶段，需要根据具体研究的信号通路/物质，选择合适的激动剂或抑制剂。

6. 自噬相关蛋白

在自噬的发生过程中，有多种自噬相关蛋白可调节和控制自噬形成的不同阶段。迄今为止，科学家已在酵母中鉴定出40余个编码ATG蛋白的基因，并且大多数在酵母和哺乳动物之间高度保守。在哺乳动物细胞中，饥饿诱导的自噬大约受20种核心ATG基因调节，它们在液泡附近被不断募集，并组装形成自噬前体。这些基因的分类和作用如下：

自噬的检测方法

在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。选择理想的检测方法对于自噬研究至关重要。常用的观察和检测方法有以下几种：

1. 透射电镜检测

自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

2. 双荧光穿梭质粒系统检测

自噬形成时，mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。

表达mRFP-GFP-LC3的小鼠胚胎成纤维细胞（左）接受饥饿处理（2小时），其中（右）或（中）不添加100 nM巴菲霉素A1（抑制自噬小体/溶酶体融合）。中间的黄色（自噬小体）和红色（自噬溶酶体）斑点都增加了，而右边的大多数斑点都是黄色的（自噬小体）

3. 单荧光质粒系统检测

利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：

• 无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；
• 自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

4. WB检测

LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。LC3亚型有：LC3A、LC3B和LC3C。LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用。

WB检测虽然是自噬最经典、公认的检测方法，但是在实际课题研究中，只有WB检测证明自噬的发生还不够。有条件建议增加其它检测方法进行证明。如果实验条件不允许，可以在实验分组中增加自噬的抑制剂、自噬的激动剂做拯救实验，正反证明自噬的发生。

自噬检测方法小结：

• 电镜检测：观察自噬不同阶段的隔离膜，自噬小体，自噬溶酶体。
• 单荧光质粒检测：GFP-LC3检测。
• 穿梭质粒检测：通过自噬溶酶体的酸碱度改变导致的GFP淬灭来观察质粒。
• WB检测：LC3. ATG family, p62(SQSTM1), Beclin 1, ULK1。

自噬研究思路

研究案例：PDIA6与非小细胞肺癌细胞凋亡和自噬的关系

通过qPCR检测，IHC检测，WB检测以及临床样本检测、存活率分析得知，PDIA6蛋白在NSCLC中表达升高，它会影响到NSCLC的发生。

对PDIA6进行干扰表达：通过CCK8实验，克隆形成实验，成瘤实验以及成瘤后IHC实验发现，干扰PDIA6表达后能够明显抑制肿瘤细胞增值以及肿瘤的发生发生。同时发现干扰PDIA6也能够促进肿瘤细胞凋亡。

本质

干扰PDIA6能够促进细胞的自噬水平。干扰PDIA6能够增加细胞的自噬水平，同时细胞凋亡水平也升高，但是这种现象被3-MA（自噬抑制剂）所抑制。

机制

通过蛋白芯片检测可得知，干扰PDIA6通过JNK和c-Jun引起肿瘤细胞的自噬和凋亡，并引起p-JNK和p-c-Jun升高。通过SP600125(JNK inhibitor)作用可发现，其能够逆转PDIA6的促进自噬和凋亡的作用。