干货！6大流式细胞术实验常见问题分析

干货！6大流式细胞术实验常见问题分析

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种高效的分析方法，能够对细胞悬液中的单个细胞进行快速分析和收集。FCM的主要优势包括速度快、结果客观，并且具备显著的统计意义。它能够处理复杂样本，同时收集多个参数，确保结果的可靠性和重复性。通过流式细胞术，研究人员可以深入分析细胞的特性、状态和相互作用。

1. 荧光抗体染色无信号或信号弱

• 抗体量不足：适当增加抗体的量或浓度，以提升信号强度。
• 细胞数量过多：调整细胞密度，确保细胞数量适中，通常应低于1×107个/ml。
• 抗体储存不当：将抗体在4℃冷藏并避光保存，避免冻存导致沉淀，从而影响染色效果。
• 荧光染料分子量过大：选择适合的分子量染料，以确保其能够顺利进入细胞。
• 一抗和二抗不匹配：确保二抗是抗一抗来源物种。
• 仪器故障：检查流式细胞仪的光学系统，包括激光器、滤光片和检测器是否正常，以确保信号检测不受影响。
• 靶蛋白不存在或表达水平低：确认靶蛋白的存在并确保其表达量足够。
• 靶蛋白的表达位置及诱导问题：确认靶蛋白的表达位置，并确定是否需要诱导才能有效表达。
• 分泌蛋白检测困难：对于分泌蛋白，使用高尔基体阻断剂以保持蛋白在细胞内，便于染色检测。
• 补偿设置过高：通过设置合适的阳性对照，调整流式细胞仪的参数，以避免过高的补偿影响信号检测。

2. 荧光强度过高

• 抗体浓度过高：减少荧光抗体的使用量或稀释倍数，以降低信号强度。
• 补偿不当：检查补偿设置，确保每种荧光染料的信号正确补偿，以避免信号重叠。
• 仪器设置问题：检查流式细胞仪的激光强度和增益设置，调整为合适水平以避免过度饱和。
• 靶标非特异性结合：优化洗涤步骤，以减少非特异性结合的影响。
• 细胞聚集：确保细胞在染色和分析过程中没有聚集，聚集会导致信号增强。

3. 应该只有一个细胞群的情况下观察到多个细胞群

• 染色不均匀：不均匀的抗体染色可能导致细胞表现出不同的荧光强度，形成多个群体。
• 有多个细胞群：样品本身可能含有多个表达靶蛋白的细胞群，但在操作过程中未能有效分离。
• 出现细胞双峰：可能观察到第一群细胞的荧光强度是第二群的两倍。这通常是由于细胞分离不充分，或者细胞团块未被过滤，导致在检测时多个细胞聚集在一起。

4. 背景高或阳性细胞百分比高

在流式细胞技术中，常见的问题之一是抗体使用过量或补偿不足。当使用多种荧光标记抗体进行染色时，不同荧光染料的发射谱可能会重叠，从而导致荧光溢漏现象。这意味着某些荧光信号会错误地被检测到其他通道中，影响结果的准确性。如果补偿设置过低，就无法有效纠正这些溢漏的信号，导致背景信号升高，并可能影响阳性细胞的准确识别及其百分比的计算。

5. 侧向散射（反映细胞的颗粒度）背景高

• 细胞裂解过度：在样品制备过程中，过度离心或振荡可能导致细胞破碎，从而产生细胞碎片。
• 细菌污染：为了从其他微小颗粒和背景信号中区分细菌群落，可以通过用荧光染料标记细菌，利用该荧光来识别目标群落。
• 死细胞的处理：流式细胞术容易受到死细胞的干扰，因为死细胞比活细胞更容易摄取抗体和探针，导致显著的非特异性染色。此外，死细胞通常具有较强的自发荧光，增加背景荧光，从而影响对某些靶蛋白弱阳性表达的观察。

6. 对照设计不合理，出现假阳性或假阴性结果

• 分析：流式实验需要设计多种实验对照，包括：
• 生物学对照：用于验证实验结果的生物学相关性。
• 空白对照：为了排除样本自带的荧光背景，设置空白对照以验证各个检测通道的信号是否为阴性。
• 同型对照（Isotype control）：由于一些免疫细胞表面存在Fc受体，为了评估抗体Fc段与靶细胞的结合情况，需要引入同型对照。在免疫细胞的流式检测中，通常要添加Fc受体封闭剂，然后再加入目标抗体的同型对照，以排除Fc受体造成的假阳性结果。
• 补偿对照（单阳性对照）：当荧光染料之间的发射光谱重叠时，信号可能扩散到多个通道，补偿是校正这种溢漏的过程。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（每个样品只染一种染料）。

设置补偿对照时需遵循四个基本原则：

1. 补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配。
2. 补偿对照的亮度需与实验样品相同或更高。
3. 对于任何对照，阴性和阳性群体的自发荧光应相同，最好为每个通道的阳性和阴性群体单独设门，避免使用通用阴性对照。
4. 补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，因此需收集足够多的事件（建议超过5000个）。

荧光减一对照（Fluorescence Minus One，FMO）：正确设门是分析流式细胞术数据的关键。当细胞群体不易界定或较为稀少时，FMO对照能帮助准确评估背景，从而在多色实验中可靠地区分阴性和阳性细胞群体。