《Cell Discovery》揭示肺腺癌转移的表观遗传调控机制
《Cell Discovery》揭示肺腺癌转移的表观遗传调控机制
中山大学黎孟枫团队在《Cell Discovery》期刊发表重要研究成果，揭示了肺腺癌转移的关键分子机制。研究发现，PHF14蛋白通过促进DNMT3B介导的SMAD7基因DNA甲基化，增强TGF-β信号传导，从而促进肺腺癌的转移。这一发现为肺腺癌的治疗提供了新的潜在靶点和预后生物标志物。
肺腺癌（LAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要组织学亚型，是全球最常见的恶性癌症类型之一。由于LAD发展早期通常难以察觉，所以大多数LAD患者在初次诊断时已经发现肺内或远处转移。TGF-β信号传导的异常激活在癌症转移和进展中起着关键作用，然而TGF-β途径失调的分子机制仍有待了解，SMAD7作为TGF-β信号转导的拮抗剂，进一步了解LAD中SMAD7转录抑制的机制可能为转移性LAD提供治疗靶点或预测预后的生物标志物。
研究发现
研究团队从TGF-β信号对肺腺癌进展中的作用着手，发现TGF-β信号与LAD患者预后不良显著相关。相继检测Smad7（TGF-β 信号转导的关键拮抗剂）的表达及甲基化水平，结果表明Smad7高表达以及高甲基化水平与LAD患者的预后呈显著相关。进一步分子验证找到了Dnmt3b（从头DNA甲基转移酶）参与Smad7 DNA甲基化和转录抑制。
Fig.1 SMAD7表达在LAD中被DNA甲基化抑制
为深入了解 DNMT3B 介导的 LAD 中 SMAD7 DNA 甲基化的具体机制，采用免疫沉淀-质谱法筛选到Dnmt3b的结合伙伴—PHF14蛋白，进一步内源和外源转入的方式证实了二者的结合；此外，在LAD细胞中过表达PHF14增强了TGF-β诱导的Smad DNA结合元件荧光素酶活性，也就是提高了Smad7甲基化水平因此降低了Smad7的表达水平。以上结果表明PHF14可能通过促进DNMT3B介导的SMAD7 DNA高甲基化和转录抑制而促进TGF-β信号的激活。
Fig.2 PHF14是DNMT3B的结合蛋白
进一步采用ChIP-qPCR分析表明，TGF-β 处理后 DNMT3B 与 SMAD7 DNA（6 个探针的区域）结合消除，而过表达PHF14可以增强这种相互作用，且Smad7 DNA甲基化水平升高；在此基础上抑制DNMT3B表达的话，能消除PHF14过表达在LAD细胞中的作用；不难发现 PHF14 在 DNMT3B 募集到 SMAD7 DNA 中起关键作用，并且是 SMAD7 DNA 甲基化和转录抑制所必需的。
Fig.3 PHF14促进DNMT3B介导的SMAD7的DNA甲基化
更为深入地研究了PHF14将Dnmt3b招募到Smad7 DNA的分子基础，构建PHF14的各种标记截断蛋白，联合免疫印迹分析发现PHF14的ePhD和中间结构域与Dnmt3b相互作用。有趣的是使用DNase I处理后，ePHD结构域和DNMT3B之间的相互作用被消除，紧跟着EMSA以及SPR实验发现PHF14 的 ePHD 结构域负责 PHF14 与富含 CG 的基序结合。
通过针对PHF14位点突变(E430AK435A)，与野生型相比，突变显著减少了PHF14对SMAD7基因的结合以及PHF14在选定区域对DNMT3B的募集，以上数据支持了 PHF14 促进 DNMT3B 催化的 SMAD7 位点上的从头 DNA 甲基化的观点。
Fig.4 PHF14可作为富含CG的基序阅读器
作者随后在体外进行相关表型验证，通过集落形成，Transwell和伤口愈合实验，共同证明了PHF14 促进 TGF-β 诱导的 LAD 进展和转移并且PHF14的肿瘤促进作用很大程度上取决于DNMT3B和SMAD7。
Fig.5 PHF14促进TGF-β诱导的LAD进展和转移
动物实验部分，通过原位注射肿瘤细胞评估小鼠体内PHF14对肿瘤转移能力的影响，结果表明PHF14的丢失显著降低了过表达TGF-β1的A549和PC9细胞形成远处转移的能力，CT扫描也显示注射了过表达TGF-β1的 PHF14 敲除细胞的裸鼠下肢骨中 TGF-β 驱动的癌性病变和组织侵袭/破坏明显减少，PHF14缺失的裸鼠表现出显著延长的无转移期和总生存期。
通过沉默 DNMT3B 或过表达 SMAD7逆转了 TGF-β1 和 PHF14 共过表达 LAD 细胞形成全身转移的能力；综上表明 PHF14 在 TGF-β 诱导的 LAD 进展和转移中具有关键且有效的促转移作用，其方式依赖于 PHF14-DNMT3B-SMAD7 轴。
Fig.6 PHF14在体内促进TGF-β诱导的LAD细胞全身转移
最后，作者评估了PHF14和SMAD7的表达是否可以指示LAD的临床进展状态，检测了肺癌细胞中PHF14的表达与正常非上皮细胞相比是显著更高的，发现PHF14高表达的LAD患者的中位生存时间明显缩短，并且发现LAD肿瘤切除后患者的SMAD7 ctDNA甲基化水平显著降低，发现ctDNA中的SMAD7 DNA甲基化水平与肿瘤负荷密切相关，并有可能用于指示患者的肿瘤进展和预后。
Fig.7 SMAD7和PHF14 作为LAD进展的有前途的诊断和预后生物标志物的潜在意义