蛋白互作研究利器：IP-MS和Co-IP技术全解析
蛋白互作研究利器：IP-MS和Co-IP技术全解析
蛋白质，作为生命活动的中坚力量，其功能一直是科研领域中的焦点。绝大多数功能性蛋白质通过与其他蛋白质的相互作用，共同调控着生命的各种过程。在研究蛋白质相互作用的过程中，蛋白质分离技术扮演着不可或缺的角色。
传统的分离技术，如电泳、色谱和沉淀法等，为我们提供了初步分离蛋白质的方法。电泳技术主要依据蛋白质的分子量进行分离，但在区分分子量相近的蛋白质时存在困难；而亲和色谱则依赖于特定的配体，并且需要特定的条件才能进行。这些传统技术在分辨率和特异性方面的局限性，激发了科学家们对开发更精确识别和分离方法的不懈追求。
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一种利用特异性抗体结合抗原，并通过沉淀富集的方式从复杂的样本中分离出目标蛋白的方法。
最初，IP技术是作为亲和柱色谱的一种改进方法而开发的，在微量离心管中使用少量的琼脂糖树脂完成。随着技术的进步，磁性微粒（磁珠）逐渐取代了琼脂糖，成为IP的优选支持物，提高了IP的纯度和可重复性。
另外，自20世纪70年代单克隆抗体技术发展以来，全面提升了抗原-抗体结合的特异性和灵敏度，使得IP在蛋白互作等领域发挥着越来越重要的作用。根据检测目的不同，IP的发展催生了免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）和RNA免疫共沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）等衍生技术，而IP结合质谱分析又诞生了免疫沉淀结合质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）。
这些技术作为如今的研究中的常客，其中IP-MS是常用的在植物体内筛选互作蛋白的有效方法，Co-IP则常用于筛选后的蛋白之间的点对点验证，ChIP是用来研究蛋白质与DNA是否在体内存在相互作用，常用来检测转录因子结合位点，RIP用来研究细胞内RNA与蛋白质结合的技术。
今天小源将选择IP-MS和Co-IP这两种技术，从原理、实验步骤、如何看结果图以及具体应用这几个角度为大家详细介绍。
IP-MS
原理
IP-MS的原理是将细胞裂解液或组织提取液等蛋白混合体系与结合有目的蛋白特异性抗体或标签抗体的磁珠进行孵化，促进“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein-A/G小珠”复合物的形成。
混合体系中能与目的蛋白相互作用的蛋白质通过特异性结合而与其他蛋白组分分离开来，通过蛋白纯化，获得与目的蛋白质相互作用的靶蛋白。
最后通过液相色谱串联质谱技术可以对酶解后的肽段进行质谱分析，从而分析与目的蛋白相互作用的未知蛋白。IP-MS不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。
实验步骤
IP-MS的实验流程如下图所示，包括：
- 材料获取：细胞或组织。
- 蛋白提取：可根据目的蛋白的特性加入不同类型的IP裂解液及抑制剂。如：非磷酸化蛋白可不添加磷酸酶抑制剂；IP背景高，选用裂解度高的裂解液；目的蛋白IP不下来，选用裂解度低的裂解液等。
- Beads结合抗体孵育：对应的抗体与Beads结合，注意须用IP抗体及实验所需的Beads载量。
- 抗体结合诱饵蛋白：诱饵蛋白与抗体结合后被固定于Beads上。
- 洗脱：把诱饵蛋白从beads上洗脱下来。
- Western Blot：评估诱饵蛋白富集程度，是否能够进行质谱检测。
- 酶解：还原-打开二硫键，烷基化-封闭巯基，胰酶酶解-打开精氨酸/赖氨酸C端肽键，脱盐-去除肽段样品盐离子。
- 质谱检测：LC-MS/MS检测样品，采集图谱，获得质谱原始数据。
- 质谱数据库检索：分析质谱原始数据，匹配蛋白数据库，获得定性及定量信息。
- 质谱质量评估：评估肽段长度，肽段数目，漏切位点等。
- 质谱数据分析：包括定量数据统计，定量数据相关性，差异蛋白筛选，PCA分析，聚类分析，GO和KEGG分析等。
应用文献案例
“CDC48A, an interactor of WOX2, is required for embryonic patterning in Arabidopsis thaliana”文中，WOX2是一个已知的调节植物胚胎发育相关的重要基因，通过IP-MS找WOX2潜在互作蛋白，其中CDC48A因为在之前的研究中被证明也与胚胎发育相关，因此被作为了重点关注的蛋白，然后通过BiFC和Co-IP进行下游验证。
从以上使用IP-MS的论文中可以发现，IP-MS的作用是筛选鉴定诱饵蛋白的相互作用蛋白，辅助选择关键互作蛋白。总的来说，针对想要研究的蛋白，深入解析其蛋白互作的分子机制，是显著提高学术文章研究水准的重要内容，IP-MS（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry）就是目前发现和揭示蛋白互作的主流技术方案。
Co-IP
原理
Co-IP的原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。基本原理也是抗原-抗体特异性结合，目的是检测蛋白间相互作用。
实验步骤
Co-IP的实验步骤可大致概括为以下4步：
- 裂解蛋白，得到蛋白的混合物；
- 将靶蛋白的抗体与蛋白混合物共同孵育；
- 洗脱，得到拉下来的蛋白；
- 再将拉下来的蛋白当作样本，用其互作蛋白的抗体进行检测。
实验结果图解读
在了解实验流程的基础上，为了来帮助大家看懂实验结果图，我们通过案例展示形式进行讲解。下图为Protein A和Protein B之间是否存在相互作用的结果图。
从图中可以得到，A蛋白带有GFP标签，B蛋白带有FLAG标签。该Co-IP实验被分为两组，一组是空载GFP标签和Protein B-FLAG共表达，另一组为Protein A-GFP和Protein B-FLAG共表达。图中有两个胶图分别为Input组和IP（α-GFP）组。
IP：即指免疫沉淀（immunoprecipitation），用相应的抗体来纯化富集目的蛋白。例如图中“IP（α-GFP）”的意思是用GFP标签抗体磁珠去拉GFP，与GFP融合表达的蛋白为诱饵蛋白，此时与该融合蛋白相互作用的其他蛋白都会因此被沉淀下来。
Iuput：指阳性对照组，是进行IP前制备蛋白样本时预留下的部分样品，做WB确认目的蛋白的存在，以排除假阳性结果的干扰。
基本情况了解后，开始进行具体的分析：
首先观察Input组，第一块胶图是利用α-GFP检测GFP标签，利用α-FLAG检测FLAG标签。结果显示第一泳道GFP标签空载体、Protein A-GFP和Protein B-FLAG均能正常显现，排除了假阳性结果的干扰且所有蛋白正常表达。
随后观察IP（α-GFP）组，阴性对照组为利用GFP标签抗体磁珠对GFP标签空载体和Protein B-FLAG混合表达的裂解液进行免疫沉淀，结果只显示检测到GFP标签空载体的条带，说明GFP标签空载体和Protein B-FLAG没有发生互作，证明了互作的特异性。
另一组则是利用GFP标签抗体磁珠对Protein A-GFP和Protein B-FLAG混合表达的裂解液进行免疫沉淀，结果显示检测到Protein A-GFP和Protein B-FLAG的条带，说明Protein A-GFP和Protein B-FLAG发生了互作。
应用文献案例
“Ca2+ sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector”文中，作者为了阐明ROD1介导的免疫抑制的分子机制，首先以ROD1为诱饵，利用酵母双杂交（Y2H）筛选出了可能与ROD1相互作用的蛋白，为验证ROD1相互作用的蛋白。
作者在本氏烟草中瞬时表达了ROD1和APIP6以及ROD1和ARIP1，验证了ROD1与两个E3泛素连接酶APIP6、RIP1相互作用关系。其中ROD1融合了GFP标签，两个E3泛素连接酶则融合了Myc标签。以单独表达ROD1和单独表达APIP1和APIP6为阴性对照，发现阴性对照正常。
同时Input组的条带可知蛋白样本中存在ROD1、APIP6和APIP1。结果D中共表达ROD1和APIP6后用带Myc抗体的磁珠进行IP（IP组第3条），用ROD1和APIP6抗体分别做WB检测，结果在ROD1和APIP6未知出现条带，说明APIP6可以将ROD1蛋白共沉淀下来及二者存在相互作用，同样根据相同的方法发现ROD1和APIP1也可以互作。
此外，通过Y2H还筛选到了一种过氧化氢酶CatB，为了确定ROD1与CatB存在互作关系，作者同样使用Co-IP的方法来验证互作关系。其中已知NLR蛋白PigmR（PigmR-CC）的卷曲螺旋（CC）结构域不与CatB相互作用，作为阴性对照。
Input组确认了几种蛋白在蛋白样本中均存在。而IP组中，PigmR-CC与ROD1不互作，无法用带GFP抗体的磁珠沉淀下二者的复合体，因此阴性对照组只有ROD1的条带。而IP组最后一个泳道检测到ROD1和CatB的蛋白条带，说明GFP抗体的磁珠沉淀下ROD1和CatB蛋白符合体，二者互作。
根据上述案例，可以发现Co-IP实验结果分析不难，关键是熟知Co-IP的实验原理和实验步骤以及实验分组的含义，再通过例子仔细耐心地实践分析即可。小源希望通过本文让大家能够了解Co-IP实验结果分析以及Co-IP实验在研究中的作用。