纠结ELISA还是Western Blot？一文带你厘清蛋白质检测方法的异同！

纠结ELISA还是Western Blot？一文带你厘清蛋白质检测方法的异同！

在生物医学研究中，ELISA和Western Blot是两种常用的蛋白质检测方法。它们各有优劣，适用于不同的实验场景。本文将为您详细介绍这两种方法的原理、操作步骤以及它们之间的主要区别，帮助您根据实验需求做出合适的选择。

免疫检测是一类基于抗体-抗原特异性结合的生物化学和生物分析技术，用于定性和定量检测各种生物样品（例如溶液、细胞裂解物、组织、血液等）中特定靶标分子的存在和浓度。这些靶标分子主要为蛋白质，但也包括与载体蛋白结合的小分子物质，例如激素、药物和毒素。ELISA和蛋白质印迹法就是用于检测蛋白质配体的存在和浓度的技术。本文将为大家介绍ELISA和Western-blot同为检测样品中的特定蛋白质的手段，有何异同。

一、酶联免疫吸附法实验

ELISA是酶联免疫吸附实验缩写，是免疫检测的黄金标准，创始人是由由Eva Engvall和Peter Perlmann于1971年首次提出。酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种广泛应用于生物分子检测的免疫学技术，以其操作相对简单、灵敏度高和可进行一定程度的并行检测而受到科研领域的欢迎。ELISA可用于检测和定量各种生物分子，包括激素、糖蛋白、蛋白质、抗体和抗原等。其基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性相互作用来识别和定量目标分子。

图1 elisa夹心法原理图

ELISA的具体操作步骤会根据不同的实验设计而有所差异，但通常包括以下几个关键步骤：

a、包被:将捕获抗体或抗原包被在聚苯乙烯微孔板上。

b、封闭:用无关蛋白封闭板上的非特异性结合位点。

c、加样:加入待测样本，使目标分子与包被的抗体或抗原结合。

d、洗涤:洗去未结合的物质。

e、结合检测抗体:加入酶标检测抗体，与目标分子结合。(根据ELISA类型，这一步可能与步骤3合并)

f、洗涤:洗去未结合的检测抗体。

g、添加底物:加入酶的底物，酶催化底物反应产生可检测的信号，例如颜色变化或发光。

h、信号检测:使用酶标仪读取信号强度，并根据标准曲线计算目标分子的浓度。

ELISA的类型多种多样，包括直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA，每种类型都有其特定的应用场景和优缺点。虽然ELISA具有诸多优势，但也存在一些局限性，例如可能受到样本基质效应的影响，以及某些情况下特异性不够高等。

二、蛋白质印迹法

蛋白质印迹法是一种广泛使用的分析技术，用于从复杂的蛋白质混合物中检测和分析特定蛋白质。它主要包括3个步骤：在凝胶上分离蛋白质、将蛋白质转移到固体膜上以及通过使用一抗和二抗标记蛋白质来可视化蛋白质。

图2化学发光蛋白质印迹检测示意图

蛋白质印迹法技术由Harry Towbin于1979年首次描述，并由W. Neal Burnette于1981年命名。蛋白质印迹法步骤如下：

a、凝胶电泳：使用凝胶电泳分离蛋白质样品。此步骤通常使用SDS-PAGE。

b、转移：分离的蛋白质被转移到固体支持物上，如硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯膜。

c、总蛋白染色：使用诸如Ponceau S、Coomasie R-350或酰胺黑等染料对膜进行染色，从而使转移到膜上的蛋白质可视化。

d、阻断：此步骤是为了阻断膜与下一步将应用的抗体之间的相互作用。由于目标分子和抗体都是蛋白质，因此膜有可能与抗体相互作用。

e、孵育：在膜上检测带有报告酶的抗体。在膜表面涂上针对该酶的特异性底物。如果发生结合，就会产生比色反应。

f、检测和可视化：未结合的探针被洗掉，凝胶中可见结合的蛋白质。

ELISA与Western Blot区别

常见问题

问题1、检测样本蛋白质，可以用ELISA代替Western Blot吗？

ELISA可以代替蛋白质印迹法，因为它是一种更灵敏的方法。但蛋白质印迹法能给出更具体、更准确的结果。

问题2、ELISA是定性还是定量检测？

Elisa可以提供定性，也可以提供定量检测

问题3、ELISA和Westernblot哪个更准确？

通常使用蛋白质印迹法来确认ELISA的结果。两种技术的结果准确率均为99.9%。

问题4、elisa检测有哪些优势？

Elisa检测成本相对较低，其次是操作简单，具有高特异性和灵敏度。

问题5、与ELISA相比，Westernblot有何优势？

与ELISA相比，Westernblot的一个优势是它是一种高度特异性的技术。用于转移蛋白质的硝酸纤维素膜具有很高的蛋白质结合能力和化学稳定性。

上述是ELISA和Westernblot介绍，相信你对两者之间的区别有所了解。如果实验是为了验证基因表达、蛋白质修饰分析和蛋白质纯化监测等比较推荐Westernblot。