手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(二)：如何评估RNA质量？

手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(二)：如何评估RNA质量？

在上一期中，我们阐述了RNA提取过程需注意的关键要点以帮助大家提取到高质量的RNA（《一文解锁RT-qPCR实验之RNA提取攻略》）。那提取完RNA的质量到底如何评估呢？今天给大家来分享一下。评估RNA的质量主要包含三个方面，分别是RNA的浓度、纯度和完整性。

RNA浓度评估

首先我们先来复习一下OD260、OD280、OD230的含义。核酸分子所含的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波长为260nm，但它无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸等杂质；蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，通常在280nm处有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰则在230nm处，如图1。

图1. 核酸、蛋白质、污染物的最大吸收峰（图源网络）

对于RNA的浓度来说，根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于40µg/ml的RNA[1]，即RNA的浓度（µg/µl）= OD260×40×稀释倍数/1000。比如OD260为0.16，2µl样本稀释至200µl，即稀释倍数为100，RNA的浓度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。

RNA纯度评估

一般来说，OD260/280=1.8-2.1，证明纯度较好，值得一提的是，OD260/280的比值会受到pH的影响，当用中性的水溶解RNA时候，RNA呈酸性，比值可能只有1.8-2.0之间；当用TE溶解RNA时，比值会稍偏高，可能在1.9-2.1之间。

1. OD260/280<1.8，可能有蛋白质或基因组的残留；
2. OD260/OD280 > 2.1，表明RNA有部分降解，如果直接将其反转得到的cDNA用于qPCR实验，可能会导致ct值偏大甚至没有ct值；
3. OD260/OD230 < 2.0，可能有盐离子、有机溶剂、碳水化合物等的污染，比如用trizol提取法中残留的的异硫氰酸胍会导致230nm处的吸光值升高，从而导致比值偏低。

当然了，纯度也可以通过琼脂糖琼胶电泳进行评估，如下图：

图2. RNA中有DNA（左）或蛋白质（右）的残留

由图2可看出，若泳道上部有明显的高分子量杂带，则可能是有DNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验的准确性造成影响（图2左）；若在胶孔处有比较亮的着色成分，则是有蛋白质的残留（图2右）。

RNA完整性评估

除了浓度、纯度外，RNA完整性也是判断RNA质量的重要指标。RNA完整性一般可通过琼脂糖凝胶电泳来进行评估。总RNA中占比达80%以上的是核糖体RNA（rRNA），因此，胶图呈现的结果主要是rRNA。

图3. 高质量RNA（左）和已降解RNA（右）的琼脂糖凝胶电泳胶图

对于真核生物来说，高质量的RNA通常有三条带，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍(图3左)，若RNA呈现弥散状，表明RNA已降解（图3右）。

在与小伙伴交流的过程中发现，很多实验室没有跑RNA琼脂糖凝胶电泳的习惯，也不清楚RNA的电泳需注意哪些要点，小翌在此做些科普：

1. 电泳槽和胶板经0.5 M NaOH浸泡0.5 h去除RNase；
2. 缓冲液和琼脂糖凝胶都需新配制，采用RNase-free H2O配制电泳缓冲液；
3. 关于marker的选择，建议使用RNA marker；
4. RNA电泳宜使用高电压短时间的方法，以防电泳过程中RNA的降解。

有些小伙伴反馈自己在样本的准备和RNA提取过程中都比较小心翼翼，但是提取的RNA质量还是不尽如人意，这时候就需要考虑是不是RNA提取试剂的问题了。在此，给大家介绍一款11min即可完成培养细胞RNA提取的的柱式提取试剂盒：培养细胞RNA提取试剂盒（Cat No.19231）。

产品特点

案例展示

使用培养细胞RNA提取试剂盒（Cat No.19231）和O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒各提取2份293T细胞（106个细胞）的总RNA。结果显示，该试剂盒提取到的目标RNA产量一致，但纯度更高，如表1和图4。

表1. Nanodrop测定RNA浓度和纯度
【注】：Y1，Y2代表培养细胞RNA提取试剂盒（Cat No.19231）；O1，O2代表O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒

图4a. hGAPDH扩增结果
图4b. hBC6扩增结果

图4.培养细胞RNA提取试剂盒的定量结果与O品牌基本一致 取1 μL洗脱液反转录，以cDNA的10倍稀释液为模板，定量测试hGAPDH和hBC6 2个基因

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参考文献

【1】Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.

以上就是本期给大家分享的内容，综合上一期内容，我们介绍了样本选择、样本采集与保存、RNA提取、RNA质量评估这四点内容。下期，我们将进入逆转录环节，不见不散~