从PCR到qPCR——关于理论、应用的演化简史
从PCR到qPCR——关于理论、应用的演化简史
PCR（聚合酶链式反应）技术自1985年问世以来，对生命科学的发展产生了深远影响。从最初的分子克隆到如今的基因检测，PCR技术不仅改变了科学研究的方式，也深刻影响了医学诊断、法医鉴定等多个领域。本文将带你回顾PCR技术的诞生历程，并介绍其演变为qPCR（实时定量PCR）的技术原理和应用。
PCR技术的诞生背景
1985年，PCR作为一种专利所属的生物技术登上分子生物学的舞台，至今还没有哪一种生物技术对整个生命科学的发展产生如此深刻的影响。PCR以其高灵敏度、高效率扩增目的DNA的特点，广泛应用于生命科学、医疗诊断、法医检测、食品卫生和环境检测等方面。
PCR（Polymerase Chain Reaction）翻译成中文的全称是“聚合酶链式反应”，简单来说，在两个短核苷酸（引物）和耐热的DNA聚合酶的作用下，首先将待扩增DNA模板加热变性解链，之后冷却至某一温度时，引物与待扩增DNA单链接合，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性－退火－延伸的过程就是一个PCR循环，不断重复，短短数十分钟就可对DNA模板进行2n倍扩增。整个反应流程大致如下：
PCR反应中所需的基本试剂组成包括：
- DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片段。
- 一对引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。
- DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。
- 脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。
- 含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
而现在成熟PCR试剂中，往往已将除引物和模板之外的反应试剂按照优化反应的参数配置成Mix，实验时在成品Mix中直接加入目的片段和相关引物，大大简化PCR实验中试剂添加过程。
PCR技术的历史发展
让我们把时间线退回至1953年，那年沃森和克里克提出了DNA是通过互补配对的碱基形成反方向平行的双螺旋脱氧核苷酸长链的结构模型。这一发现为后续的DNA复制机制研究奠定了基础。
1969年，美国印第安那大学的微生物学家Thomas Brock和他的研究生Hudson Freeze从黄石国家森林公园火山温泉中发现了一种嗜热型海栖热袍菌T.aquaticus (Taq)，为后来1976年Trela和他的华裔研究生钱嘉韵Alice Chien分离纯化到耐受>75°C热稳定Taq DNA聚合酶奠定了坚实的基础。
1971年，Kleppe等人在分子生物学杂志上发表了后来被称为“指导PCR在技术具备可行性”的文章，他在这篇文章中提出了修补复制 (repair replication) 的概念，这就是后来被学界称为PCR技术的雏形。
1979年，Sanger在《美国科学院院刊》PNAS上发表了题为“链末端终止DNA测序法”的文章，提到了寡核苷酸引物、DNA聚合酶和能终止反应引物延伸的、修饰过的核酸可用于DNA测序实验。
1983年5月的一个周五夜晚，Mullis在从加州湾区前往Mendocino县的乡间小屋的途中，灵感突现，提出了指数扩增DNA的构想。从1983年9月起，Mullis陆续进行了一些实验，换过几种DNA模板，也尝试过不同的升温、降温周期，结果都不理想。
1986年春，Mullis首次提出使用耐高温酶的想法。经过文献搜索，果然找到了两篇有关文献，较早的一篇是在美国做的，另一篇则是俄罗斯科学家的成果。第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的工作，是一位来自台湾的年轻科学家钱嘉韵。1973年，钱嘉韵到俄亥俄州的辛辛那提大学生物系就读。她的导师J. Trela对一种在黄石公园的温泉里发现的嗜热菌（Thermus aquaticus，Taq）感到好奇，就让钱嘉韵及另一位美国学生以该细菌为论文研究的题目。在另一位老师的指导下，钱嘉韵成功地从该细菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，并将研究成果发表在1976年的Journal of Bacteriology上。
1986年6月，Saiki首度将Taq DNA聚合酶应用于PCR，效果就好得惊人，可以说是一炮打响。Taq DNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时其专一性及活性都比之前使用的大肠杆菌DNA酶更强，背景杂带也几乎都消除了。自此，PCR大获成功。1991年12月，Hoffmann Roche药厂据称以三亿美元购得了Cetus的PCR技术专利，Cetus公司也走进了历史。
qPCR技术的原理与应用
随着生物实验需求的不断发展，PCR技术在其发展的历程中，已经逐渐演化出一系列侧重于不同实验目的及应用的PCR分类，其中较为常见的包括：touchdown PCR、multiplex PCR、qPCR以ddPCR。这里，我们着重介绍一下qPCR的基本原理及其广泛应用。
Quantitative PCR，又称为real-time PCR，是一种在DNA扩增反应中，以荧光染料或荧光标记探针侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量，并以荧光信号的形式被qPCR仪内的光学检测系统识别，最后通过绘制相关标准曲线对未知样本模板进行定量分析的方法。相比起传统的PCR，qPCR可对样本进行定量分析。
常规PCR后会将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，属于简单的定性分析。而qPCR 在反应体系中引入了荧光基团（染料或者探针），可借助于对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，是一种相当准确的定量方式。
由于需要精确定量起始模板，因此qPCR结果中有两个特定的参数对评估过程至关重要，第一个参数是扩增曲线。以下图为例，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度或者相对荧光强度。反应开始时，荧光信号不稳定，呈现波动状态，随后信号会趋于稳定并且呈现指数性增长，到达一定循环数之后，荧光信号强度不再增加，持续稳定。扩增曲线展现出来为一条S型曲线，包括：基线期，指数扩增期，平台期。反应完成后，qPCR仪会以基线期荧光信号标准偏差的10倍生成一条阈值线，阈值线与扩增曲线产生交点，交点对应的横坐标代表Ct值，Ct值的含义代表每一个反应体系中荧光信号强度达到阈值时经历的扩增循环数，是后续定量计算的基础。
第二个重要参数就是熔解曲线。熔解曲线在反应完成之后进行检测，反映温度和荧光值之间的关系。此类检测只适用于染料法，探针法因探针水解后不能还原，故无法做此分析。从下图求导后的结果可以看出，一个峰对应一次荧光信号的跌落，每次跌落代表在这个温度范围内有一个双链产物被大量解链，因此单峰代表只有一个特异产物，多于一个峰代表存在非特异扩增产物或者引物二聚体，溶解曲线帮助我们判断的是反应的特异性。通过扩增曲线和熔解曲线分析，只有完整而且特异的反应，Ct值才真实可信，才能用于后续的定量计算。
对于qPCR实验结果的后续数据分析，通常采用如下线性函数计算：定义初始模板量为X0，第n次循环之后产物量为Xn，那么在理想PCR条件下，Xn=X0×2n，非理想PCR条件下，我们定义引物扩增效率为Ex，Xn=X0×(1+Ex)n，两边同时取对数，将Ct值和达到Ct时产物的量X(Ct)代入整理的公式，lgX0= (- lg(1+Ex) )×C(t)+ lgXc(t)这个最终的方程表明初始模板浓度的对数与Ct值呈线性关系，根据该线性关系，可用Ct值来进行后续表达量的计算。
在现实科研中，常常需要考虑比扩增曲线和熔解曲线更为复杂的参数指标。这里有一篇发表在临床化学上的review，The MIQE Guidelines，给出了在发表文章时所必需的最低的限度信息标准，同时该文章对qPCR的术语、概念、研究与临床应用、样本的采集、处理和制备、核酸的质量控制、反转录、qPCR过程及数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。
虽然qPCR仪器的品牌和型号很多，但从工作原理上分析，都包含以下三个反应模块：激发光发射源，接收装置，PCR反应模块。
由于体系中引入了荧光基团，需要激发光发射源发出一定波长的光线，遇到荧光基团会反射另外一个波长的光线，此时被接收装置实时接收，正是由于qPCR仪比普通PCR仪增加了这两个模块，因此，qPCR的耗材比普通PCR的耗材要求更高，其顶盖的透光性必须良好。在做qPCR时不能徒手或者戴乳胶手套接触顶盖，一定要佩戴PE手套操作，防止杂质留在顶盖上影响荧光信号的发射及接收。
按照qPCR的定量方式，可分为SYBR染料法、TaqMan探针法、分子信标。
SYBR染料法利用SYBR Green I分子可结合于所有双链DNA（多重PCR扩增扩多少？丨启衡星StarLighter Multiplex PCR Mix来助力！新冠病毒检测与QPCRdsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料这一特点来实现定量。SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光，游离的染料分子不发光，在新合成链延伸过程中SYBR Green I 掺入双链中，变性时DNA双链解开，SYBR Green I 游离出来，无荧光。由于非特异扩增产物和引物二聚体均为dsDNA，所以SYBR染料法只能通过引物来保证特异性，其优点在于简单且成本较低，适用于样本量较少的科研客户。
TaqMan探针法的核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。
qPCR反应开始时，双链模板经加热变性解链成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行单链延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’的外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，形成一个荧光分子，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。
分子信标类似于TaqMan探针，游离的状态下探针互补形成发卡结构，5’端藕联发光基团，3’端藕联淬灭基团。这种状态下发光基团和淬灭基团距离较近，发光基团发出的荧光会产生荧光共振能量转移现象（FRET），激发淬灭基团后信号衰减。当反应体系温度升高时，发卡结构的探针被打开，分子信标茎环区与模板链退火并结合，发光基团跟淬灭基团分离后因距离较远而不会产生FRET现象，释放的荧光信号被机内的接收装置检测到，新合成的互补链替换该分子信标，脱离模板链的信标分子又重新形成发卡结构而不再释放荧光信号。
总结一下定量方式的选择，一般情况下，在科研中，绝大多数定量会选择便宜且方便的SYBR染料法；如果有更严格的定量需求，可以选择TaqMan探针法；在医疗检验中，优先选择准确并且特异的TaqMan探针法。此外，SYBR染料法适用于特异性要求不是特别高的反应、分子数（拷贝数）超过1000的反应、探针实验前进行预实验、PCR条件非常成熟、无二聚体、无非特异扩增；TaqMan探针法适用于特异性要求较高的实验、多重PCR（StarLighter 多重PCR预混液，FS-P7001）（标记不同的荧光基团）、SNP检测、灵敏度要求较高的实验。分子信标因背景荧光极低及其高的特异性而适用于SNP检测。