改造这种Cas9，基因编辑效率提升百倍！诺奖得主Doudna最新成果再登《细胞》
改造这种Cas9，基因编辑效率提升百倍！诺奖得主Doudna最新成果再登《细胞》
30多年前，一位名叫Francisco Mojica的博士生在来自地中海海滩的古菌体内，发现了一种在当时难以解释的重复性碱基序列。之后，Mojica为这些序列起名为“常间回文重复序列簇集”（Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats）。全名很拗口，但它的缩写却耳熟能详——CRISPR。
后面的情节我们都很熟悉了。最近十多年间，CRISPR已经成为生物学、农业和医学等领域的主角，而其中的里程碑当属Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授在2012年的研究——她们开发了CRISPR-Cas9基因编辑系统，利用Cas9核酸内切酶实现了特定位点对DNA的精准切割。现在，CRISPR-Cas9已经成为编辑人类细胞的“魔剪”，这两位女性科学家也收获了2020年诺贝尔化学奖。
但CRISPR的故事还远没有结束。科学家们仍在挖掘CRISPR-Cas9的潜力，开发更高效、安全、应用范围更广的基因编辑工具。通过蛋白质工程的改造，科学家们已经能够扩展CRISPR-Cas9能够靶向的位点、降低脱靶的风险……不过，有一个改造目标蛋白质工程始终收效甚微，那就是提升Cas9的基因编辑活性。
▲Jennifer Doudna教授（图片来源：加州大学伯克利分校）
现在，Doudna教授又一次取得了重要突破。通过对被长期忽视的结构域的改造，一种杆菌Cas9酶的基因编辑活性提升了超过100倍。根据进一步的研究，Doudna教授团队带来的酶活性修改器还可以增强更多Cas9的基因编辑能力，有望为高效基因编辑系统的开发提供普适性策略。
相关进展在线发表于最新一期《细胞》期刊。这也是2022年Doudna教授团队在数千种病毒中发现大量基于CRISPR的潜在基因编辑工具后，研究成果再次登上《细胞》。
这项研究的主角，是一种早在100多年前就被分离出的细菌——嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）。有研究发现，相比于目前常用的Cas9，嗜热脂肪地芽孢杆菌的Cas9酶（GeoCas9）有着更长的蛋白质寿命，因此科学家推测GeoCas9应该具有更强的基因编辑活性。
然而实验结果却事与愿违，GeoCas9在人类细胞中的实际编辑效果很差。一方面，GeoCas9的热稳定性限制了它的活性；另一方面，我们知道Cas9需要首先识别底物DNA上名为PAM（即前间隔序列邻近基序）的序列才能与DNA结合、进行切割，但GeoCas9需要识别的PAM太长了，这也限制了其能编辑的基因范围。
面对这些困境，Doudna教授的解题思路是定向演化。研究团队推测，对GeoCas9的定向演化可以提升其编辑效率、减少对PAM序列长度的需求。为此，他们使用了一种细菌双质粒筛选系统，用于寻找演化活跃的突变。
在结合了8个有益突变后，研究团队得到了一个全新的GeoCas9突变体，名为iGeoCas9（意为improved GeoCas9）。其靶向双链DNA切割能力大幅提升，热稳定性得到了保留（因此在脂质纳米颗粒递送中有巨大潜力）。
▲iGeoCas9-sgRNA-DNA复合物的冷冻电镜与卡通结构（图片来源：参考资料[1]）
进一步的实验证实，iGeoCas9进行基因编辑的效率是原始的GeoCas9的100倍以上。此外， iGeoCas9有着更强的PAM适配性，可以识别更广泛的PAM序列。
为什么iGeoCas9能够实现基因编辑能力的大幅提升？在最新论文中，Doudna教授团队借助冷冻电镜对iGeoCas9与野生型GeoCas9的结构进行分析，发现关键在于一个意想不到的区域——楔形 (wedge，WED) 结构域。
简单来说，Cas9蛋白包括了几个关键的结构域，它们发挥着各自的关键功能。例如，HNH和RuvC结构域是Cas9的“剪刀”，分别切割目标链与非目标链；PI结构负责识别、定位PAM序列……相比之下，参与PAM和sgRNA识别的WED结构域似乎没有那么重要，甚至并非所有细菌的Cas9都含有这个结构域。
但在分析iGeoCas9的结构时，研究团队发现，WED结构域上的3个突变负责改善iGeoCas9 的编辑能力，与目标双链DNA建立新的相互作用，从而增强与DNA的结合。同时，突变使得iGeoCas9识别PAM的门槛要求降低了，因此适用于更多DNA序列的切割。
接下来的研究也揭示了其中的机制——与双链DNA结合能力的提升显著加速了DNA解旋，通过降低PAM的特异性来增加目标序列范围。
▲研究示意图（图片来源：参考资料[1]）
WED结构域的作用是iGeoCas9的特例，还是可以拓展到其他Cas9中？
带着这样的疑问，研究团队将类似的WED结构域突变引入另一种热稳定性Cas9——Nme2Cas9中，发现突变同样增强了其基因编辑活性。相比于野生型Nme2Cas9，经过改造的iNme2Cas9基因编辑效率同样提升了100倍以上。
▲WED结构域突变显著提升了Nme2Cas9的基因编辑活性（图片来源：参考资料[1]）
接下来，研究团队还将经过改造的iGeoCas9、iNme2Cas9与目前最先进的SpyCas9（来自酿脓链球菌）进行了对比。结果，在多个不同的位点上，iGeoCas9都展现出了与SpyCas9相当的基因编辑效率。
因此这些实验说明，WED结构域是Cas9目标识别的关键调节因子，对于提升GeoCas9、Nme2Cas9等II-C型CRISPR编辑器的基因编辑效率，同时保留其热稳定性有着重要意义。
更加令人欣喜的是，尽管不同系统中WED结构域的组织结构不同，但对II-A型CRISPR编辑器SpyCas9的初步研究显示，其同样有潜力通过这一手段进行改造，进一步提升编辑效率。因此，基于对双链DNA结合区域的改造，Doudna教授团队的最新策略有望开发出更广泛、高效的基因编辑系统，以及更强大的CRISPR疗法。
参考资料：
[1] Eggers et al., Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9.Cell (2024) DOI: 10.1016/j.cell.2024.04.031
[2] Chen et al., Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR-Cas9 RNP. bioRxiv [Preprint] (2023). DOI: 10.1101/2023.11.15.566339