实验干货｜蛋白质浓度测定之BCA法的技巧

实验干货｜蛋白质浓度测定之BCA法的技巧

BCA法（Bicinchoninic Acid assay）是一种广泛应用于实验室的蛋白质浓度测定方法。与Lowry法相比，BCA法操作更加简便，试剂稳定性更好，且几乎不受其他干扰物的影响。与Bradford法相比，BCA法不受去垢剂的影响，具有更高的灵敏度。本文将详细介绍BCA法的实验原理、所需物资与设备、具体操作步骤以及注意事项，帮助读者掌握这一重要的蛋白质定量技术。

BCA法实验的原理

BCA是一种稳定的碱性水溶性复合物。在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA Reagent A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应，形成紫色的络合物。该水溶性的复合物在A562 nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

BCA实验物资与设备

物资清单

1. BCA试剂盒：通常包含BCA溶液A与B，使用前需按比例混合均匀。
2. 蛋白质标准品：一般采用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，用于绘制标准曲线。
3. 比色皿：可选用96孔板或其他规格，用于盛放样品并进行光度测量。
4. 离心管：用于样品的制备与储存。
5. 移液器及配套吸头：用于精确量取与添加不同体积的液体。
6. 去离子水：用于配制溶液与稀释样品

设备介绍

光谱光度计：在BCA法测定蛋白质浓度的过程中，光谱光度计是需要的仪器，它用于测量样品在特定波长（562纳米）下的吸光度。在选择光谱光度计时，应关注以下几点：

• 精确度：仪器必须能够精确读取至0.001吸光单位的变化。
• 波长范围：确保设备能够覆盖所需的测试波长，特别是BCA法所需的562纳米。
• 处理能力：根据实验规模，选择具有合适读取速度与样品处理能力的光度计，如单孔至多孔板光度计。

BCA实验操作步骤

微孔板检测

1. BCA工作液配制。根据标准品和样品数量，按50体积BCA 试剂A加1体积BCA 试剂 B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
2. 标准曲线绘制。取一块酶标板（酶标板的板底是不能用手去触碰的，一般拿的是侧壁），按下表数据加入试剂：
3. 样品准备：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20 ul样品，加入200 ul BCA工作液（蛋白液：工作液=1:20）。加样时枪要轻柔吹打，将其中液体混匀。
4. 振荡混匀后，37℃放置20 ~ 30 min。冷却至室温。颜色变化如下图：
5. 用酶标仪测定A562 nm处的吸光值，以不含BSA的吸光值为空白对照。
6. 以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
7. 根据测得的吸光值，在标准曲线上即可计算出样品的蛋白含量。
8. 计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20 ul，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

微孔板检测

1. BCA工作液配制。根据标准品和样品数量，按 50 体积BCA Reagent A加1体积BCA Reagent B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
2. 选取7支洁净试管，其中6支标号1~6号管（包含第1支空白管），另外1支标记待测管。按照下表用移液器准确移取相应的标准蛋白溶液或待测样品、蒸馏水和BCA工作液于试管中。
3. 取适量体积的标准蛋白（根据情况用去离子水适度稀释），以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。
4. 然后吸取各试管中的溶液于比色皿中并用分光光度计的562nm波长比色测定吸光度值。

BCA实验注意事项

• 为保证蛋白浓度测量的准确性，最好做3个复孔，必要时剔除离群值。
• BCA法测蛋白浓度易受时间及温度的影响，所以最好每次测定都做标准曲线。
• 加样时一定要准确加样且尽可能避免气泡产生，以免影响测量（加样结束可以用注射器戳破气泡，并将96孔板放在摇床上混匀片刻，以使样品与工作液充分接触）。
• 孵育结束应尽快检测吸光度，并尽可能加快检测速度，以免带来误差。