γ-氨基丁酸（GABA）检测方法详解

γ-氨基丁酸（GABA）检测方法详解

γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的神经递质，在生物体内发挥着重要的生理作用。随着科学研究的深入，对GABA的检测方法也提出了更高的要求。本文将介绍几种常用的GABA检测方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、质谱法（MS）和酶联免疫吸附法（ELISA），并详细阐述每种方法的具体操作步骤和注意事项。

GABA别名是4-氨基丁酸，化学式为C4H9NO2，分子量为103.1，能溶于水，不溶于苯，乙醚等。是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于脊椎动物，植物和微生物中。常用溶剂萃取，柱分离制备，也有微生物发酵。在植物的生理代谢过程中，具有抗逆和调控作用。

1. 高效液相色谱法（HPLC）

样品处理

称取组织-加入裂解液-匀浆-超声-离心-取上清-过滤。

色谱条件

使用C18色谱柱，柱温一般为30-40℃或指定的温度。流动相一般用甲醇和乙腈，或乙腈和三水合乙酸钠，流速为1.0ml/min，根据实际情况调整。紫外检测器，波长为338或248nm，在实际测定的过程中，需要进行方法验证，确定最佳的检测波长。进样量为10uL，进样测定。

标准曲线

将标准品进行稀释，成倍的，梯度稀释至少6个浓度。这几个浓度点要覆盖到检测器的最佳的检测范围之内，测定出来的色谱峰，对峰面积进行积分，结合对应的标准溶液浓度，可以绘制出标准曲线，得到回归方程。相关系数r2一般情况要大于0.999，重复性符合要求。方法学上，需要考虑回收率。

样品测定

样品的测定条件和标准品是一样的，记录出峰的情况。对色谱峰面积进行积分，根据标准曲线，是可以计算出样品的GABA含量。

2. 气相色谱法（GC）

样品处理

前面的方法也是裂解-匀浆，接着是丙酮沉淀蛋白，离心取上清。不同的是，使用GC测GABA含量，是需要对样品的残留提取物进行衍生化处理，比如与10%乙酰氯异丙醇液和三氟醋酐进行酯化和酰化反应，生成GABA衍生物。

色谱条件

使用毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器。主要的是设置进样温度，柱温，梯度升温，载气氮气流速，进样分流比，空气或氢气压力等。

同样，采用标准曲线的方法，计算出样品中的GABA含量。可以参考文献，根据对应的方法测定。

3. 质谱法（MS）

质谱一般是和液相或气相联合使用的，在前期的处理后，在色谱柱和流动相的分离提取，进入质谱离子源，形成碎片离子。在质谱的质量分析器内，电磁场的作用下，根据质荷比（m/z）进行分离，并到达最终的检测器上，形成质谱峰。对质谱峰进行解析，结合标准曲线，可以更准确的定量。

4. 酶联免疫吸附法（ELISA）

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）。往预先包被γ氨基丁酸（GABA）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在浓酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ氨基丁酸（GABA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。